蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母混菌發酵效果探究

程國富，鄭自強，衛春會，黃治國

（1.四川宇晟酒業投資管理有限公司成都分公司，四川成都 610000；2.四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereusFrankland)屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），革蘭氏陽性菌，菌體兩端較平整，多呈鏈狀排列，是一種好氧性細菌，可產抗菌、增香物質，抑制不利環境微生物的繁殖[1-3]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是白酒釀造的主體菌種，可將原料中的氨基酸等前體物質轉化為重要風味物質，并合成多種酶，對白酒的產量和風味有重要影響[4]。

隨著我國白酒產業的迅速發展，單一菌種的普遍應用引起白酒風味特征同質化，商業競爭力降低，混菌發酵逐漸受到關注，混菌發酵能改變發酵產物的風味特征，改善酒質，使風味更加豐富、濃厚[5]。在白酒釀造過程中，微生物混菌發酵研究也十分典型，徐巖等[6]將釀酒酵母和異常畢赤酵母(Pichia anomala)共培養的結果表明，混菌發酵可豐富醛類物質的種類，高級醇含量與總酸含量相對減少，有效改善了發酵液的風味特性，有利于增加發酵產物的風味復雜性。吳軒德等[7]利用混菌發酵采用同步接種和順序接種方式研究了釀酒酵母與巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)的相互作用有利于乙酸乙酯的合成，其最高達595.72 mg/L±5.01 mg/L，是單菌發酵的10.1倍。

目前，微生物在白酒生產中的作用研究，主要是通過提高功能微生物在發酵過程中的濃度來改善白酒品質，雖然已經取得了一些進展，但對功能微生物的篩選應用還存在不足，同時缺乏發酵過程中重要微生物之間互相作用的研究以及應用微生物在發酵過程結構變化的解析，從而在本質上對發酵過程機理認識不足[8]。俗話說“好曲產好酒”，而大曲在曲中表現出優良的性能，從大曲中篩選芽孢桿菌并運用于曲，更具有研究意義，本研究以前期從高溫大曲中篩選得到的蠟樣芽孢桿菌為研究對象，檢測分析蠟樣芽孢桿菌的生產性能，探究蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母共發酵的效果，以期有效提高白酒品質，為中國白酒釀造機制提供參考依據，為微生物相互作用運用于釀造工業生產提供理論背景[9]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

蠟樣芽孢桿菌：從川南某醬香型白酒廠高溫大曲中分離得到的菌種；釀酒酵母：釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室菌種。

可溶性淀粉、酪素、濃鹽酸、蔗糖、葡萄糖、氫氧化鈉均為分析純，甲醇、正己烷均為色譜純，盧氏碘液，購自成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉和瓊脂均為生物試劑，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

儀器設備：LRH-250 生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；ZHWY-103D 恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；MLS-3020 全自動高壓蒸汽滅菌鍋，北京艾飛博科技有限公司；DZKW-4 水浴鍋，北京市中興偉業儀器有限公司；7890A-5975B 氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent；Sherlock 微生物鑒定系統，美國MIDI；Scan1200 全自動菌落分析儀，上海智理科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，用氫氧化鈉調節pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

液態發酵培養基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉2.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：原料按高粱∶麩皮∶水=3∶2∶4配比60 g，接入5 U/g α-淀粉酶，以30 ℃恒溫水浴2 h；淀粉酶液化，接入150 U/g 糖化酶60 ℃恒溫水浴20 h，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的生理生化和耐受性

菌落形狀確定：分別取兩株菌株于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基平板涂布，37 ℃恒溫倒置培養24 h，觀察記錄菌落形態。

生理生化試驗：參照鐘小廷等[10-13]《產細菌素蠟樣芽孢桿菌的篩選、鑒定及培養基優化》的步驟及方法，分別對菌株進行革蘭氏染色、糖發酵試驗、淀粉水解試驗、乙酰甲基甲醇試驗、過氧化氫酶試驗。

耐受性試驗：①制備菌懸液：取0.9%的生理鹽水9 mL，接種稀釋至10-1、10-2、10-3，分別取樣，用血球計數板計數，鏡檢，配制濃度梯度為10-7～10-8的菌懸液。②溫度耐受性試驗：移取1 mL 菌懸液于細菌種子液LB 培養基，分別于35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃，在轉速170 r/min 搖床中培養24 h，于600 nm下測定培養液的吸光值，并計數；③pH 值耐受性試驗：移取1 mL 菌懸液于細菌種子液LB 培養基，控制溫度為40 ℃，調節初始pH 值分別為5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00，在轉速170 r/min搖床中培養24 h，于600 nm 下測定培養液的吸光值，并計數；④耐乙醇試驗：移取1 mL 菌懸液于細菌種子液LB 培養基，控制溫度為40 ℃，初始pH7.0，調節初始乙醇濃度分別為6 %vol、8 %vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol，在轉速170 r/min 搖床中培養24 h，于600 nm 下測定培養液的吸光值，并計數。

1.2.3 菌種在液態發酵中的相互作用

接種順序對蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母混菌發酵的影響：分別按不同順序接種于液態發酵培養基，37 ℃，150 r/min 搖床中培養2 d，并計數[14-15]。接入時間對蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母共發酵的影響：分別以0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h的時隔接入液態發酵培養基，37 ℃、150 r/min搖床中恒溫培養2 d，并計數。全程均無菌操作，所有試驗均做3 個平行試驗。

1.2.4 菌種固態發酵對比研究

固態單發酵：取B-1、B-2 蠟樣芽孢桿菌1×107CFU/mL 11 mL 于不同固態發酵培養基中，在37 ℃下發酵20 d。固態共發酵：先接入B-1、B-2蠟樣芽孢桿菌1×107CFU/mL 11 mL 于不同固態發酵培養基中培養4 h 后，分別接入釀酒酵母1×107CFU/mL 11 mL，在37 ℃下發酵20 d。空白：接入空白細菌種子液LB 培養基11 mL，空白土豆培養基11 mL，在37 ℃下發酵20 d。

1.2.5 發酵產物風味分析

樣品前處理：稱取3 g 固態發酵樣品于頂空瓶中，將頂空瓶放入全自動固相微萃取儀中，于55 ℃平衡10 min，萃取30 min。氣相色譜條件：DBWAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細管色譜柱；進樣口溫度230 ℃；分流比20∶1；程序升溫：50 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升至150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持2 min，載氣：99.999 %氦氣，載氣流速：1 mL/min。質譜條件：電離電壓70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電離方式為EI，全掃描。

1.2.6 數據處理

通過固相微萃取氣相色譜質譜聯用法（HSSPME-GC-MS）檢測分析蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母混菌發酵產物，采用NIST8.0 譜庫檢索分析風味物質成分；利用SPSS 軟件進行方差分析，數值以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌的形態和生理特性

從形態分類結果分析（圖1），B-1 號菌株單菌落為白色，直徑為1～3 mm，邊緣不光滑，不透明，菌落比較干燥，易挑取，且挑起無黏性；B-2 號菌株單菌落為白色泛紅色，直徑為1 mm，菌落扁平，較干燥，易挑取，且挑起無黏性。兩株菌均為革蘭氏陽性菌，菌株均能利用葡萄糖以及蔗糖產酸，且產過氧化氫酶和淀粉酶（表1）。

圖1 蠟樣芽孢桿菌菌落形態和革蘭氏染色鏡檢圖（10×100）

表1 蠟樣芽孢桿菌生理生化鑒定結果

2.2 蠟樣芽孢桿菌的耐受性

培養條件影響細菌的生長、代謝活動，適宜的培養環境能使菌株生長情況良好，有利于發揮其生產性能。適宜的溫度能使細菌有效地吸收培養基中的營養成分，也同時影響菌株的應激性[14]。蠟樣芽孢桿菌的生長、代謝不僅可能會產生酸類物質，改變環境酸度，而且不適宜的外部酸度環境也對其活性有調控作用，導致其生長及代謝異常[17]，同時，高濃度的乙醇是一個典型的極端條件，更高的乙醇耐受性有助于蠟樣芽孢桿菌運用于實際釀造生產[18]。不同培養溫度對菌株的影響結果見表2，不同初始pH值對蠟樣芽孢桿菌的影響結果見表3，不同初始乙醇濃度對菌株的影響結果見表4。

表2 不同培養溫度對蠟樣芽孢桿菌的影響

兩株菌的最適生長溫度為37 ℃左右，最高耐受溫度為65 ℃，熱耐受性情況基本相同，過高的培養溫度會降低菌株的存活率，故蠟樣芽孢桿菌的培養溫度應控制在37～40 ℃為宜。

表3 不同初始pH值對蠟樣芽孢桿菌的影響

當生長環境趨近中性條件時，B-1、B-2均能有較好的長勢，芽孢桿菌在中性的環境下能實現生物量的最大富集。故控制B-1、B-2 菌株在中性或弱酸性條件下生長有助于提高其生產性能。

表4 不同初始乙醇濃度對菌株的影響

B-1 菌株在較高的乙醇濃度下仍然生長良好（最大耐受濃度為16 %vol），較B-2 菌株表現出更高的乙醇耐受性（最大耐受濃度為14 %vol），同種菌內在生理特性差異會在一定程度上表現出不同的脅迫表征，致使在相同的釀造條件下，B-1 菌株表現出更優良的生產性能。

2.3 菌種的相互作用

液態發酵適應現代化工業生產，原料適應性強、輔料用量少，且能極大地改善勞動、生產環境[17]，模擬蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母液態混菌發酵環境能一定程度體現其實際生產價值。發酵過程中，不同的接種順序以及接種時間會影響菌株的營養利用情況，從而影響菌株代謝，不同的接種順序、接種時間對液態共發酵影響分別見圖2、圖3。

圖2 不同接種順序對菌種數量影響

由圖2 可知，先接入釀酒酵母，后接入蠟樣芽孢桿菌的接種順序可使蠟樣芽孢桿菌數量與釀酒酵母較為接近，B-1 菌株接種情況整體較B-2 菌株略好。混菌發酵相較于單獨酵母培養，雖然蠟樣芽孢桿菌數量相對減少，但仍處于一個數量級，這是由于釀酒酵母的發酵過程會產酸，致使發酵環境處于酸性條件，從而抑制了適合于中性生長環境的B-1、B-2 蠟樣芽孢桿菌的生長；編號4 中酵母菌數量極少，蠟樣芽孢桿菌在此培養條件下生長較快，成為優勢菌種，吸收了釀酒酵母生長代謝所需的營養物質，抑制了釀酒酵母的生長；編號5 釀酒酵母與蠟樣芽孢桿菌相差一個數量級，可能為同等環境下，蠟樣芽孢桿菌相較于釀酒酵母優先進入對數生長期，優先獲取發酵液中營養，故長勢優于釀酒酵母，但混菌發酵的營養物質受限，相較于編號2 數量更少。綜合上述結果：編號3 即先接入釀酒酵母，后接入蠟樣芽孢桿菌的接種順序更有助于蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母共混菌酵，利于實際生產。

兩株菌生長情況差異較小，先接釀酒酵母，時隔4 h 接入蠟樣芽孢桿菌的接種方式可使蠟樣芽孢桿菌數量級與釀酒酵母數量級最為接近。在時隔少于4 h 接入蠟樣芽孢桿菌的發酵培養基中，蠟樣芽孢桿菌數量遠大于釀酒酵母，分析其原因，蠟樣芽孢桿菌的生長周期較短，生長4 h 左右便進入對數生長期，消耗了釀酒酵母代謝所需的營養物質，隨著接種時隔繼續延長，酵母抑制蠟樣芽孢桿菌的生長，成為優勢菌株，可能是酵母代謝產物的積累對蠟樣芽孢桿菌有抑制作用。綜合上述結果，接入蠟樣芽孢桿菌后，最適接入釀酒酵母時間為4 h。

圖3 不同接種時間對菌種數量影響

2.4 混合固態發酵的代謝產物分析

固態發酵法是生產大曲酒應用最廣泛的釀造方法之一，其法有增糧香、改善酒質等優點。故本研究模擬固態釀造環境，利用HS-SPME-GC-MS對發酵液進行風味物質成分鑒定[19-21]，探索兩株蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母混菌發酵的代謝性能，各香味成分鑒定結果見表5。

由表5 可知，混菌發酵相較于單菌發酵，共新增27 種風味物質，醇類、酯類、酚類、酸類、醛酮類、雜環類及烷烴類化合等風味物質均有所增加，特別是醇類及酯類物質產量有較大提高。丙二醇、苯乙醇在單菌發酵中均未檢測到，而B-1、B-2 混菌發酵的苯乙醇產量分別達12.86 mg/kg、13.71 mg/kg，對促進形成酒體風味、促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用；單菌發酵產酯類較少，其中辛酸乙酯、α-戊基-γ-丁內酯、苯乙酸乙酯、丙位辛內酯均只產生在混菌發酵中，酯類具有增香作用，混菌發酵可促使酒體呈香多樣性上升，放香更為飽滿協調。酚類物質如愈創木酚主要呈現出煙熏風味，為醬香型白酒的重要香味成分，具有良好的抗氧化活性，B-1 單菌發酵愈創木酚含量為2.5 mg/kg，B-2 單菌發酵愈創木酚含量為4.20 mg/kg，而混菌發酵產量分別提升至4.6 mg/kg，5.30 mg/kg，增香效果顯著。在酸類方面，產乙酸能力混菌發酵表現為協同作用，其中B-1 從不產乙酸到產量提升為13.90 mg/kg，B-2 混菌發酵也更有益于乙酸的生成，酸類物質在白酒風味中起調和、烘托作用，使酒體口感更為醇和。雜環類化合物主要產物為2,3-二甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪等吡嗪類物質，B-1 菌株共發酵菌株產量由8.5 mg/kg 提高至16.40 mg/kg，B-1 與釀酒酵母混菌發酵表現出明顯的優勢，B-2 菌株則表現出更良好的生產性能，B-1 混菌發酵與單菌發酵相比，新產生了2,3-二甲基-5-乙基吡嗪等風味物質，且四甲基吡嗪含量有較大提升，其具有擴張血管，改善血循環、護肝等功效，為白酒中的健康風味成分[22-23]。固態發酵環境下，混菌發酵表現出更好的協同作用，促進了乙酸乙酯、乙酸、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、麥芽醇、1-十五炔等27 種風味物質的生成，其中醇類、酯類、吡嗪類物質所占比例較大，可有效增加風味成分豐富度，凸顯酒體主要呈香，使放香更為飽滿協調。愈創木酚、四甲基吡嗪等有益風味成分的提升在改善酒質，發掘其藥理作用方面具有積極影響。

3 結論

本研究是從川南某醬香型白酒廠高溫大曲中分離得到兩株蠟樣芽孢桿菌，檢測分析蠟樣芽孢桿菌與釀酒酵母生產性能，并模擬液態和固態發酵環境，探索混菌發酵與單菌發酵差異，為混菌發酵運用于釀造生產提供理論參考。其中蠟樣芽孢桿菌對釀酒酵母的生長有一定的抑制作用，但通過調節添加方式可以削弱這種抑制效應。蠟樣芽孢桿菌和釀酒酵母協同固態發酵能夠促進乙酸乙酯、乙酸、苯乙醇、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、麥芽醇、1-十五炔等27 種風味物質的生成，特別是能提高愈創木酚、四甲基吡嗪等有益風味成分產量，這將有利于改善白酒酒質，同時能發掘其藥理作用方面具有積極影響。

表5 混菌發酵與單菌發酵香味成分分析鑒定結果 (mg/kg)