光及補料條件對室內管道光反應器中三角褐指藻 生長和巖藻黃素積累的影響

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

巖藻黃素（fucoxanthin）又名巖藻黃質，分子式為C42H58O6，與其他常見類胡蘿卜素（β-胡蘿卜素、蝦青素）不同，作為丙二烯類胡蘿卜素，除含特殊的共軛雙鍵外，還含有單環氧基、羰基和羥基等基團[1]。因此，巖藻黃素有極強的抗氧化性，在抗炎癥、抗癌、抗糖尿病、減肥、護肝等方面有獨特的生物活性[2]，在食品、醫藥、化妝品行業應用價值較高。目前，商業化巖藻黃素主要從海帶（Laminaria）、枝管藻（Cladosiphon）、馬尾藻（Sargassum）、裙帶菜（Undaria）等大型褐藻中獲得，但它們的巖藻黃素含量極低，通常僅0.01～4.96 mg/g[3]，厚實的細胞壁及豐富的藻膠使其巖藻黃素提取和純化成本過高[4]。海洋硅藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）有生長速率高、可規模化培養的優點，同時巖藻黃素含量高達15.42～16.51 mg/g，且較易提取[5]，被公認為藻基巖藻黃素的新來源。

目前，開放式（跑道池）和封閉式光生物反應器（管道、柱狀、平板等）已應用于三角褐指藻的人工培養[6]。但跑道池的環境因素難控制，易受敵害生物污染，生產效率低下；柱狀和平板反應器大多局限于實驗室規模[7]，不利于規模化培養；以色列已實現三角褐指藻的戶外管道光反應器規模化培養[8]，但依然存在戶外環境因素可控性差、生產性能不穩定的問題。與戶外培養相比，室內人工光源下溫度和光照易于精準調控，為保障三角褐指藻的生產效率提供了新方向。本研究以三角褐指藻為研究對象，系統探討室內管道光反應器中不同光源和調光策略、重復補料分批培養和半連續培養條件對三角褐指藻細胞生長和巖藻黃素積累的影響，為室內可控規模化培養三角褐指藻生產巖藻黃素提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與保藏

三角褐指藻（P.tricornutumCCMP 1327）由中國科學院水生生物學研究所胡晗華研究員惠贈，藻種用f/2固體斜面培養基[9]保種，保存溫度4 ℃。

1.2 材料與儀器

巖藻黃素標準品購于美國Sigma公司；海鹽購自美國Marineland公司；胰蛋白胨購自廣東環凱微生物科技有限公司；叔丁基甲醚、甲醇為色譜純，丙酮、甘油、尿素等為分析純，均購于廣州卯林儀器有限公司；Accuri C6 流式細胞儀購自美國BD公司；YMC carotenoid column C30 色譜柱購自美國Phenomenon公司；ATC鹽度計購自上海淋譽貿易有限公司；SevenEasy pH電極、DOG-209F溶氧電極、WK-206溫度電極購自上海兆福環保科技有限公司；CH-ZTW臭氧發生器購自廣州創環臭氧電器有限公司；KCTF-100超濾膜系統購自仕必純貿易上海有限公司；Modulyod冷凍干燥機購自美國熱電公司；AWY-18W日光燈管購自中山市奧文照明電器有限公司；HS-5730-60LED LED燈管購自深圳華盛照明有限公司。

1.3 方法

1.3.1室內管道光生物反應器構建 室內管道光反應器如圖1所示，由150 L PVC集氣桶、PMMA有機玻璃管（直徑10 cm，裝有比丘射流管）、光源（日光燈或LED燈）、循環水泵等組成，總體積470 L（授權中國實用新型發明專利CN201820049703.7）。藻液的超濾采收裝置由多個孔徑0.3 μm的中空纖維超濾膜組件并聯構成。

圖1 室內470 L管道光生物反應器實物圖和示意圖Fig.1 Physical drawing and schematic diagram of 470-L indoor tubular photobioreactor

1.3.2培養條件與系統控制 三角褐指藻種子液培養采用改良的兼養f/2人工海水培養基[9]，配方：海鹽20 g/L，甘油9.20 g/L，胰蛋白胨1.17 g/L，尿素0.30 g/L，NaH2PO4·H2O 10 mg/L，Na2SiO3·9H2O 30 mg/L，FeCl3·6H2O 3.15 mg/L，Na2EDTA·2H2O 4.36 mg/L，CuSO4·5H2O 9.80 μg/L，Na2MoO4·2H2O 6.30 μg/L，ZnSO4·7H2O 22 μg/L，CoCl2·6H2O 10 μg/L，MnCl2·4H2O 180 μg/L。一級種子液在250 mL錐形瓶中制備（兼養培養基裝液量為100 mL），接入斜面藻苔1環培養至對數期。二級種子液是將一級種子液由250 mL錐形瓶轉移到2 L錐形瓶中培養（裝液量1 L，接種量為10%）。培養條件：溫度（20±1）℃，照度（3 000 ± 500）lx，搖床轉速160 r/min。

在室內管道光反應器中，采用f/2人工海水培養基[9]進行自養培養（氮源為 1.76 mmol/L NH4HCO3）。對培養基及整個培養系統進行臭氧消毒后，接入二級種子液，接種密度為4.00×106mL-1。培養過程中溫度由溫度電極檢測并與空調開關相連，當溫度超過24 ℃，開啟空調降溫；當溫度降至20 ℃，空調自動停止。培養過程中pH由工業pH電極檢測，并通過減壓閥和CO2鋼瓶相連，當pH超過8.10，減壓閥開啟通入CO2；當pH降至7.90，減壓閥關閉停止通入CO2。培養過程中溶氧由溶氧電極檢測（在飽和亞硫酸鈉溶液中校零，設置20℃、空氣通氣量150 L/min條件下f/2培養基溶解氧為100%），并通過變頻器和水泵相連，當溶氧超過200%，調節變頻器加大泵的流速，加速溶解氧釋放。

1.3.3室內日光燈為光源的調光-分批培養 非調光組全程維持照度800 lx，調光組照度前3 d為800 lx，后5 d為3 500 lx。培養過程中每天取樣，并記錄pH、溶氧、溫度的變化，及時檢測細胞密度、NH3-N濃度、生物量，鏡檢三角褐指藻生長情況。藻液經離心、洗滌3次得到藻泥，真空冷凍干燥后得到藻粉，用于測定巖藻黃素。

1.3.4室內LED燈為光源的階段式調光-重復補料分批培養 日光燈和LED燈光譜數據如圖2及表1所示。比較冷白光日光燈和全光譜LED燈的光譜差異可見，二者均為白光，所以主波長較為接近，但LED燈中紅光占比較高（表1）。在自養條件下紅光占比更高的光源可促進三角褐指藻生物量的積累[10]。而LED燈光譜分布較為均勻，在藻類主要光合作用范圍（420～450、630～690 nm）[11]內均有較高的絕對光譜值；日光燈光譜分布不均，并在綠光波長范圍內擁有較高的絕對光譜值，不利于三角褐指藻中巖藻黃素的積累[12]。此外，LED燈發熱較少[11]，比日光燈節省約75%的輸入功率[13]。因此，用LED光源代替日光燈光源，通過適當調光并配合補充氮源進行分批培養。

培養過程中階段式調節照度：10 000 lx（0～0.5 d）、3 300 lx（0.5～3 d）、6 000 lx（3～4.5 d）、5 000 lx（4.5～6 d）、10 700 lx（6～7 d）、13 000 lx (7～17 d)、5 500 lx（17～19 d）。當NH3-N濃度低于0.88 mmol/L時補料，分別在3、7、13 d時補料，共3次。第1次補NH4HCO3至NH3-N濃度為1.76 mmol/L，第2次補氨水至NH3-N濃度為1.76 mmol/L，第3次補氨水至NH3-N濃度為2.64 mmol/L。其余培養條件同1.3.2。

圖2 冷白光日光燈和全光譜LED燈的光譜曲線Fig.2 Spectral curves of cold white fluorescent light and full-spectrum LED light

表1 不同光源的光譜分析Table 1 Spectral analysis of different light sources

1.3.5室內LED燈為光源的梯度調光-重復補料半連續培養 采用LED燈為光源，培養過程中梯度調節照度：2 000 lx（0～2 d）、5 000 lx（2～4 d）、8000 lx（4～6 d）、11 000 lx（6～9 d）、14 000 lx（9～13 d）、4 000 lx（13～18 d）、7 000 lx（18～23 d）、10 000 lx（23～25 d）、14 000 lx（25～29 d）。分別在3、6、12 d時共補氨水3次，前2次補氨水到NH3-N濃度為1.76 mmol/L，第3次補氨水到NH3-N濃度為2.64 mmol/L。當生物量超過1.57 g/L后，采收部分藻液，回用上清液，使生物量回到初始狀態，并補充氨水至NH3-N濃度為2.64 mmol/L，同時補充鐵、硅、磷等微量元素，含量達f/2培養基初始濃度后繼續培養直到采收。其余培養條件同1.3.2。

1.4 分析測試

各指標分析時，每個樣品均設3個平行，取平均值并計算標準差。

1.4.1生物量[14]三角褐指藻生物量B（g/L）采用干重法測定。吸取2 mL藻液，裝于已烘干稱重的2 mL離心管中，離心，洗滌，所得藻泥放入80 ℃恒溫烘箱烘至恒重。分析天平稱量并計算差值。

1.4.2細胞密度和比生長速率[15]細胞密度（mL-1）采用流式細胞儀測定。吸取2 mL藻液于2 mL離心管中，離心、超純水洗滌，所得藻泥用超純水重懸至上機濃度，用流式細胞儀測定。

比生長速率μ（d-1）計算公式：

其中，N2和N1是時間點t2和t1的細胞密度（mL-1）。

1.4.3NH3-N濃度[14]NH3-N質量濃度（mg/L）采用意大利HANNA HI 83200多參數水質分析儀測定，專用試劑為HI93715。取待測上清液稀釋NH3-N至0～10 mg/L，先后滴加試劑HI93715A、HI93715B反應后進行分析。

1.4.4巖藻黃素的提取及測定[15]稱量凍干藻粉10 mg，置入裝有適量陶瓷珠的凍存管中，加入1 mL預冷的提取液 [V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1）]，震蕩器震蕩30 s后，用液氮迅速冷凍，離心，收集上清液至15 mL離心管。反復多次提取直至藻粉變白。合并上清液，用氮氣吹干有機溶劑，加入定容劑[V(甲醇)∶V(叔丁基甲醚)=1∶1，含質量分數0.1%的二丁基羥基甲苯]定容至1 mL，經0.22 μm微濾孔膜過濾至棕色樣品瓶中，用于后續巖藻黃素檢測。

藻粉巖藻黃素含量采用高效液相色譜法（HPLC）法檢測，全程在無光或弱光下進行。HPLC系統采用美國Waters雙1525泵和2996二極管陣列檢測器，YMC carotenoid column C30柱（4.6 mm × 150 mm，3 μm）。流動相由甲醇(A)和叔丁基甲醚(B)組成，梯度（體積分數）洗脫：0～6 min，95%→80% A、5%→20% B；6～12 min，80%→60% A、20%→40% B；12～19 min，60%→55% A、40%→45% B；19～20 min，55%→95% A、45%→5% B；20～23 min，95% A、5% B。流速0.80 mL/min，進樣量20 μL，440 nm下測定巖藻黃素含量。依據上述條件，按照文獻[15]建立巖藻黃素標準曲線，分析藻粉巖藻黃素含量F（質量分數，mg/g）、藻液巖藻黃素質量濃度ρ（mg/L）及巖藻黃素產率R[mg/(L·d)]。算式：

其中，F和B是t時刻的巖藻黃素含量和生物量，F0和B0是t0時刻的巖藻黃素含量和生物量。

1.4.5數據分析 采用 Microcal Origin 8.5 Software對數據進行處理和統計學分析；采用t檢驗確定各組間差異，P＜ 0.05為顯著差異，P＜ 0.01為極顯著差異。

2 結果與討論

2.1 室內日光燈光源的調光-分批培養三角褐指藻生長及巖藻黃素累積效率

室內日光燈光源下三角褐指藻生長及過程參數變化見圖3。

由圖3_a可知，3 d時提高照度后，調光組細胞增長顯著提高，平臺期縮短，氨氮消耗加速。培養結束時，細胞密度和平均比生長速率分別達1.29×107mL-1和0.16 d-1（表2），分別是對照組的1.14倍和1.23倍（P＜ 0.05）；氨氮平均消耗速率為2.09 mg/(L·d)，是非調光組的1.14倍（P＜ 0.05）。研究表明，隨著細胞密度升高，細胞間的光遮蔽作用增強，導致單個細胞的照度下降[16]。因此，適當提高照度可緩解光遮蔽，促進三角褐指藻生長[17]，加速營養鹽消耗。

表2 日光燈光源自養培養三角褐指藻的生產性能Table 2 Production capacity of P.tricornutum using fluorescent light as light source under autotrophic growth

三角褐指藻的適宜生長溫度和pH分別為15～25 ℃[18]和8.00[15]。圖3_b表明，在培養過程中除個別時間點外，兩培養組溫度基本維持在23～27 ℃，較利于三角褐指藻生長。圖3_c可見，培養過程中兩培養組pH基本維持在7.50～8.20；提高照度后（3 d時），調光組氨氮快速消耗，導致pH下降至7.57；6 d后氨氮消耗減慢，pH基本穩定在8.00左右。圖3_d可見，培養過程中非調光組的溶解氧水平較低；而調光組溶解氧在調光后急劇增加，并5 d時達到最高值202%，5 d后，隨著細胞密度的增加，溶解氧持續下降，表明隨著光遮蔽效應加劇，導致細胞內光合放氧作用降低[19]。

室內日光燈下，調光對三角褐指藻生物量和巖藻黃素積累的影響見圖4。提高照度可顯著提高細胞密度，但培養結束時兩組生物量之間并無顯著性差異（圖4_a）。WANG等[20]在自養條件下發現，適當提高照度可顯著增加三角褐指藻生物量，與本研究結果有所差異，這可能是因為本研究中培養后期氨氮含量過低，限制了三角褐指藻生物量的進一步積累[21]。圖4_b表明，培養結束時調光組藻粉巖藻黃素含量、藻液巖藻黃素質量濃度和巖藻黃素產率分別可達17.35 mg/g、9.42 mg/L和0.91 mg/(L·d)，分別比非調光組提高17.15%、17.90%和13.75%（P＜ 0.05）。研究發現，當照度從弱光提升至中等弱光時，三角褐指藻巖藻黃素含量提高42.86%[22]，與本研究結果類似。因此，在室內日光燈光源下，提升照度可顯著促進三角褐指藻的細胞生長及巖藻黃素積累（P＜ 0.05）。

圖4 室內日光燈階段調光對三角褐指藻生物量及藻粉巖藻黃素含量、藻液巖藻黃素濃度和巖藻黃素產率的影響Fig.4 Effects of the staged increase of light intensity on biomass and fucoxanthin content in alga powder,concentration in alga suspension of Phaeodactylum tricornutum and fucoxanthin productivity under indoor fluorescent light

2.2 室內LED燈為光源的階段式調光-重復補料分批培養三角褐指藻生長及巖藻黃素累積效率

調光-重復補料分批培養的三角褐指藻生長和參數變化見圖5。由圖5_a可知，0～11 d時細胞穩定增長，但兩次補料后氨氮消耗速率逐漸下降；11～13 d時細胞進入平臺期，此時補料，在富氮條件下積累巖藻黃素[20]；13～19 d時，細胞密度先下降后增加。培養結束時細胞密度和平均氨氮消耗速率分別達3.34 × 107mL-1和4.04 mg/(L·d)（表3），分別是日光燈調光組的2.60倍和1.93倍（P＜ 0.01）。

圖5 室內LED燈下階段式調光-重復補料分批培養下細胞密度和NH3-N濃度及溫度、pH、照度和溶氧的變化Fig.5 Changes of cell density and NH3-N concentration,temperature,pH,light intensity and dissolved oxygen with the staged increase of light intensity and repeated fed-batch culture under indoor LED light

表3 LED燈下三角褐指藻的生產性能Table 3 Production capability of P.tricornutum under LED light

圖5_b可見，pH在培養過程中基本維持在7.60～8.10。前7 d溫度基本維持在19～22 ℃，7 d時照度升至13 000 lx后，溫度逐步升至28 ℃，導致細胞增長和氨氮消耗放緩（圖5_a），17 d時照度降至5 500 lx后，溫度逐漸降到23 ℃，細胞開始增長。研究表明，溫度會影響微藻酶活性及營養吸收[23]，因此，溫度高于25 ℃時，三角褐指藻細胞增長受抑制，甚至凋亡[18]。此外，初始照度為10 000 lx，導致初始溶氧高達80%。在1～3 d時，隨著照度降至3 300 lx，溶氧降至30%以下；隨著培養過程中照度階梯式提高，溶氧持續降低，可能因為照度提升幅度過大，使三角褐指藻受光抑制，導致細胞放氧活性和光合效率下降[24]。由圖6_a可知，培養結束時三角褐指藻的生物量和產率分別可達1.57 g/L和63.48 mg/(L·d)（表3），分別是日光燈調光組的2.91倍和1.31倍（P＜ 0.05）。由圖6_b可知，巖藻黃素含量在培養過程中呈現波動式變化。隨著前2 d細胞分裂加速而導致的快速生長，巖藻黃素含量急劇下降；3 d時補料后，巖藻黃素含量短暫上升；11 d時細胞進入平臺期（圖5_a），巖藻黃素含量快速提高，并在15 d時巖藻黃素含量最高，為17.36 mg/g，比接種時提高14.89%（P＜ 0.05）；16 d后，隨著細胞密度再次增加，巖藻黃素含量逐漸降低，但生物量快速提高，并在17 d時巖藻黃素濃度及產率最高，分別為24.37 mg/L、1.17 mg/(L·d)，分別是日光燈調光組的2.52倍（P＜ 0.01）和1.08倍（P＞ 0.05）。

圖6 室內LED燈階段調光-重復補料分批培養對三角褐指藻生物量、藻粉巖藻黃素含量和藻液巖藻黃素濃度的影響Fig.6 Effects of the staged increase of light intensity and repeated fed-batch culture on biomass,fucoxanthin content in alga powder and concentration in alga suspension of Phaeodactylum tricornutum under indoor LED light

由此可見，與日光燈調光組相比，以LED燈為光源進行調光-重復補料分批培養，可極顯著強化三角褐指藻生物量和巖藻黃素含量（P＜ 0.01）。

2.3 室內LED燈梯度調光-重復補料半連續培養中三角褐指藻生長及巖藻黃素累積效率

由于階段式調光條件下，照度提升幅度過大使三角褐指藻受光抑制，以及在半連續培養條件下，培養基回用可減少培養中養分和水損失，降低成本，節約資源[25]，因此，進行LED燈梯度調光-重復補料半連續培養的實驗。

由圖7_a可知，第一階段內細胞密度穩定增長，在13 d時最大，為3.16×107mL-1。藻液采收及培養基回用進入第二階段，出現3 d的延滯期；隨后細胞密度開始緩慢增長，27 d后細胞進入平臺期，最終細胞密度僅為1.78×107mL-1，顯著低于第一階段（P＜ 0.05）。研究表明，在培養過程中三角褐指藻會產生大量胞外多糖分泌物[26]，而超過100 ku的胞外多糖會抑制微藻生長[27]，推測回用培養基中可能存在的胞外分泌物抑制了三角褐指藻的生長。此外，在第一階段，隨著細胞密度快速增加，氨氮快速消耗，其平均氨氮消耗速率可達4.38 mg/(L·d)（表3）。在第二階段前3 d，細胞處于延滯期，氨氮幾乎不消耗；隨著細胞密度的增長，氨氮開始消耗，但其平均氨氮消耗速率僅為1.74 mg/(L·d)（表3），極顯著低于第一階段（P＜ 0.01）。

圖7_b可見，培養過程中溫度基本在25 ℃以下，pH值基本維持在7.80～8.20，較利于三角褐指藻生長[11,14]。此外，溶氧基本維持在200%以上，可能是因為細胞可及時適應照度梯度式增強，未受光損 傷[24]，從而使胞內光合作用加強，溶氧不斷上升。

圖7 室內LED燈梯度調光-重復補料半連續培養下細胞密度和NH3-N濃度以及溫度、pH、光照強度和溶氧的變化Fig.7 Changes of cell density and NH3-N concentration,temperature,pH,light intensity and dissolved oxygen with the gradient increase of light intensity and semi-continuous culture on under indoor LED light

三角褐指藻生物量和巖藻黃素含量及藻液巖藻黃素濃度見圖8。圖8_a表明，三角褐指藻在第一階段培養結束時（13 d）生物量和產率分別可達到1.64 g/L和105.83 mg/(L·d)。第二階段最終生物量僅為0.73 g/L，極顯著低于第一階段（P＜ 0.01）。如圖8_b所示，在兩個階段中，藻體巖藻黃素含量（干基）均先降后升。第一階段初期，隨著細胞的快速分裂，巖藻黃素含量逐漸下降；3～10 d時，巖藻黃素含量基本不變；10～12 d時，細胞進入穩定期，巖藻黃素含量逐漸提升，并在補料后急劇上升，13 d時達到最大值17.56 mg/g，此時三角褐指藻的巖藻黃素質量濃度和產率分別為28.76 mg/L（圖8_b）和1.90 mg/(L·d)（表3），分別比LED調光-重復補料分批培養的最高巖藻黃素濃度和產率提高18.01%（P＜ 0.05）和62.39%（P＜ 0.01）。第二階段培養初期，氮含量充足，但細胞處于延滯期，巖藻黃素含量不斷上升；15～26 d時，隨著細胞持續增長，巖藻黃素含量不斷下降；27 d后，細胞生長進入穩定期，巖藻黃素含量急劇增加，培養結束時達到16.34 mg/g，與第一階段無顯著性差異，但巖藻黃素產率極顯著低于第一階段（P＜ 0.01）。因此，梯度調光有利于三角褐指藻生物量的積累；但培養基回用后，細胞生長受抑制且延滯期過長，導致三角褐指藻生長和巖藻黃素積累的總體效率顯著降低（P＜ 0.05）。

圖8 室內LED燈梯度調光-重復補料半連續培養對三角褐指藻生物量、藻粉巖藻黃素質量分數及藻液質量濃度的影響Fig.8 Effects of the gradient increase of light intensity and semi-continuous culture on biomass,and fucoxanthin content in alga powder,and concentration in alga suspension of Phaeodactylum tricornutum under indoor LED light

綜上所述，在優化后的LED梯度調光-重復補料半連續培養模式下，三角褐指藻細胞密度、生物量，巖藻黃素質量分數和產率分別達3.16×107mL-1、1.64 g/L、17.29 mg/g、1.90 mg/(L·d)，分別是初始日光燈非調光條件下的2.77倍、3.09倍、1.17倍和2.38倍（P＜ 0.01）。目前，三角褐指藻規模化培養主要是在戶外跑道池中進行，宋培欽等[15]在戶外跑道池中分別獲得22.71 mg/(L·d)和0.53 mg/(L·d)的生物量產率和巖藻黃素產率，均明顯低于本研究；在室內平板反應器中，Guler等[28]自養培養三角褐指藻的最高巖藻黃素產率為1.10 mg/(L·d)，也明顯低于本研究的最高巖藻黃素產率。目前有關管道光反應器中規模化培養三角褐指藻的研究基本集中在油脂積累[8,29]方面，有關巖藻黃素積累的報道較少。因此，本研究開發的室內管道培養積累巖藻黃素的操作工藝有創新性，可顯著強化三角褐指藻的生物量和巖藻黃素積累，為室內管道反應器規模化培養三角褐指藻生產巖藻黃素提供重要技術支持。

3 結語

本研究表明，在室內管道光反應器自養體系下，采用LED燈、梯度提升照度及重復補料半連續培養模式，可顯著促進三角褐指藻生物量和巖藻黃素產率，對開發建立管道反應器中生產巖藻黃素的規模化培養技術有重要指導意義。在后續研究中，需進一步探討不同光質（紅光、藍光、綠光）及其組合對三角褐指藻生長和巖藻黃素產率的影響，有利于繼續提升規模化生產巖藻黃素的效率和降低生產成本。