鹽度對威氏海鏈藻生長和生化指標的影響

陳墅鑫，羅莎莎，張吉澳，李長玲,2，黃翔鵠,2

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518000）

威氏海鏈藻 (Thalassiosira weissflogii) 隸屬于中心硅藻綱 (Centricae) 海鏈藻屬 (Thalassiosira)，是我國南方養殖蝦塘的優勢藻種之一[1-3]。其富含多不飽和脂肪酸，尤其是EPA和DHA，可促進對蝦幼體的生長發育，可作為對蝦開口餌料或橈足類等浮游動物營養強化餌料，已廣泛應用于對蝦育苗[4]。

威氏海鏈藻可有效去除養殖水體中的氨氮，有凈化養殖水質的功能。王培明等[5]利用威氏海鏈藻和側孢短芽胞桿菌（Brevibacillus laterosporus）組成的菌藻聯合體吸收水體氨氮，指出威氏海鏈藻為菌藻復合體吸收氨氮的主要貢獻體，其最高貢獻率可達84%。因此，定向培養威氏海鏈藻有重要意義。鹽度是微藻生長的重要生態因子，然而，已有研究主要針對綠藻門和硅藻門部分種類在不同鹽度條件下對于某物質的吸收或者同化效果等，鮮見關于威氏海鏈藻藻細胞在不同鹽度下的適應性研究。本研究分析在不同鹽度條件下威氏海鏈藻生長和生化組分變化，為定向培育威氏海鏈藻并應用于養殖池塘水環境水質調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用威氏海鏈藻由廣東海洋大學藻類資源開發與養殖環境生態修復實驗室中國南方對蝦池塘分離純化并保種。取指數生長期藻液用于實驗。

主要儀器有上海博訊BSG-300光照培養箱、250 mL三角錐瓶（蜀牛）。采用f/2培養基進行連續不充氣密封培養。培養體積為200 mL。實驗初始接種密度為5×105個/mL，實驗期間光/暗周期為16 h L/8 h D，溫度為 (28 ± 0.5) ℃，照度為 (3000 ± 100) lx，pH 8.0 ± 0.2。實驗鹽度梯度為5、15、25、35、45，每個梯度設3個生物學重復。培養周期為8 d。每天早中晚3次定期搖勻藻液，每2 d取樣1次。

1.2 藻細胞密度測定

實驗期間，每次取樣后使用血細胞計數板（25 mm×16 mm）在光學顯微鏡下計數威氏海鏈藻細胞密度。比生長率μ(d-1) 計算：

式中，N1和N0分別是t1和t0時的細胞密度。

1.3 色素含量測定

采用熱乙醇提取法[6]。用5 μm的混合纖維素膜收集5 mL藻液，棄濾液，將收集的濾膜置冰箱-20 ℃條件下暗處理16 h，加入體積分數為95%、80 ℃預熱的乙醇5 mL，置于80 ℃水浴鍋中2 min，避光室溫靜置4 h，以5 000 r/min離心10 min，用分光光度計測定上清液在480、510、630、664、750 nm處測定光密度值D。根據下式計算葉綠素a[7]和類胡蘿卜素[8]含量。

ρ(葉綠素a)=11.47×D664-0.40×D630，

ρ(類胡蘿卜素)=7.6 × [(D480-D750) -1.49 × (D510-D750)]。

式中，D480、D510、D630、D664、D750分別為480、510、630、664、750 nm下光密度。

1.4 藻細胞可溶性總糖含量測定

用苯酚硫酸法[6,9]測定，葡萄糖含量標準曲線：

Y=0.005 4X+0.260 3，R2=0.998 7，

其中，Y為光密度值，X為葡萄糖濃度（μg/mL）。

樣品前處理參照韓謙等的堿提法[9]。每次取藻液5 mL，于5 000 r/min 條件下離心10 min，去除上清液，用各鹽度梯度海水洗滌兩次。加入0.305 mol/L的NaOH溶液1 mL，混勻，置58.5 ℃下水浴68 min，以5 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液用于可溶性總糖含量的測定。

1.5 藻細胞總蛋白含量測定

參照洪廷等[10]方法對樣品進行前處理。每次取2.5 mL藻液，以5 000 r/min 離心10 min，去除上清液，用各梯度海水洗滌2次，藻泥加入0.305 mol/L的NaOH溶液1 mL，混勻，置74.5 °C下水浴69 min。以5 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液，用考馬斯亮藍法[6,11-12]測定總蛋白含量。以牛血清蛋白為標準品制作標準曲線。蛋白含量標準曲線：

Y=0.002 4X+0.736 4，R2=0.997 2，

其中，Y為光密度值，X為總蛋白質量濃度（μg/mL）。

1.6 藻細胞中性脂含量測定

取藻液適量，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸藻細胞至350 nm下光密度值D(350 nm) 為1.0。取1 mL藻液，以5 000 r/min離心5 min，去除上清液，藻細胞沉淀用PBS洗2次，加入1 mL 體積分數20%二甲基亞砜溶液。于38 ℃下水浴18 min，每1 mL藻液加入20 μL尼羅紅染料（質量濃度為0.1 mg/mL丙酮溶液），混勻，染色5 min，取250 μL于酶標板中，使用多功能酶標儀，激發波長480 nm，測定其在570 nm的熒光強度。

1.7 數據分析

用SPSS 19.0對實驗數據進行單因素方差分析，用Duncan’s 多重比較對均值進行差異顯著性分析，P＜ 0.05 表示有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 不同鹽度對威氏海鏈藻細胞密度和比增長率的影響

圖1可見，不同鹽度條件下，威氏海鏈藻8 d時各組藻細胞密度平均值達到最高，鹽度對威氏海鏈藻生長影響顯著（P＜ 0.05），培養6 d時，鹽度25組威氏海鏈藻細胞數顯著高于鹽度5組和45組（P＜ 0.05）；培養8 d時，鹽度25和鹽度35組細胞密度平均值均為2.0×106mL-1，較實驗初始密度（5×105mL-1）增長4.0倍。但培養期間，鹽度變化對比生長率影響無統計學意義（P＞ 0.05）（表1）。

圖1 不同鹽度條件下威氏海鏈藻細胞密度Fig.1 Cell density in Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

表1 不同鹽度條件下威氏海鏈藻比生長率Table 1 Specific growth rate of Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

可見，鹽度25時藻細胞生長最佳，鹽度5和鹽度45組生長較慢，各組藻細胞密度平均值在培養8 d時達到最大。這與陳長平等[13]對底棲硅藻新月筒柱藻（Cylindrotheca closterium）的研究結果一致。鹽度25與鹽度5、鹽度35組培養期間，藻細胞密度無顯著差異（P＞ 0.05），但當鹽度變化對藻細胞形成脅迫時，藻細胞生長速度則顯著降低。當硅藻細胞受到鹽度脅迫時，藻細胞可通過主動運輸將離子輸送出細胞膜或進入液泡[14]，以及通過細胞滲透調節劑來減少鹽脅迫的影響[15]。這些細胞活動均需耗能，因此鹽度脅迫可延緩或抑制細胞分 裂[16]。同時高鹽等不良環境易導致硅藻細胞產生一種細胞外多聚物 (Extracellular Polymeric Substances,EPS) 的黏性物質[17]，EPS可在細胞遭遇不良環境時起保護作用，有抗失水、防止細胞硅質壁溶解、減少滲透壓的作用，還有穩定群落組成功能[18-19]。綜上，鹽度過高或者過低均會對微藻細胞增長產生抑制作用，但威氏海鏈藻藻細胞有硅質細胞壁，可在一定程度上抵抗外界滲透壓改變對藻細胞造成的影響。細胞自身有一定的滲透壓調節能力，所以在培養8 d時，各鹽度環境下威氏海鏈藻藻細胞密度均可達到較高水平。

2.2 不同鹽度條件下威氏海鏈藻色素含量

圖2表明，鹽度對威氏海鏈藻葉綠素a含量有顯著影響（P＜ 0.05），培養2～6 d期間各組葉綠素a含量均呈現不同程度積累，且鹽度45組葉綠素a含量顯著低于鹽度15和25組（P＜ 0.05）。鹽度15時，培養6 d時葉綠素a質量濃度平均值最高，為3.4814 μg/mL，較初始值（2.2183 μg/mL）增加1.6倍，顯著高于鹽度45組。推測當鹽度處于45時，鹽度脅迫對藻細胞的光合系統產生抑制作用，導致其光合色素合成受抑制。這與余錦蘭等[20]對小新月菱形藻 (Nitzschia closteriumf.minutissima) 高鹽度脅迫響應的研究一致。據報道，高鹽度會影響葉綠體內囊體膜的穩定性，同時細胞內的Na+和Cl-增加，影響葉綠素和葉綠素蛋白的親和性，同時激活葉綠素酶活性，加速葉綠素分解[21]。

圖2 不同鹽度條件下威氏海鏈藻葉綠素a含量Fig.2 Chlorophyll A content in Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

如圖3所示，培養期間各實驗組類胡蘿卜素含量均呈現上升趨勢，鹽度15組培養8 d時類胡蘿卜素質量濃度平均值最高，為2.354 9 μg/mL，較初始值（1.079 3 μg/mL）增加2.2倍，顯著高于鹽度5和鹽度45組（P＜ 0.05）。類胡蘿卜素是威氏海鏈藻的重要色素組成，可反映藻細胞的生長狀態，同時有抗氧化作用，可清除氧化自由基。據報道，在一定范圍內提高鹽度可增加藻類類胡蘿卜素的積累[22-23]。但當鹽度過高或過低而對藻細胞形成脅迫時，類胡蘿卜素的合成將受到明顯抑制。

圖3 不同鹽度條件下威氏海鏈藻類胡蘿卜素含量Fig.3 Carotene content in Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

2.3 不同鹽度條件下威氏海鏈藻總糖含量

圖4可見，實驗期間各組藻細胞可溶性總糖含量均呈先降后升的趨勢，且不同鹽度環境對藻細胞總糖積累效果有顯著影響（P＜ 0.05）。這與陳長平等[13]對新月筒柱藻的研究一致。實驗0～2 d，各組總糖含量均呈下降趨勢，推測此時藻細胞處于接種后的恢復期，需分解糖類為細胞正常生理活動提供能量。鹽度25組在培養4～6 d期間，總糖含量積累顯著優于鹽度5和鹽度45組（P＜ 0.05）。鹽度15組培養8 d時總糖質量濃度平均值最大，為123.17 μg/mL，較初始值（40.430 μg/mL）增加3.0倍。鹽度45組培養0～4 d總糖含量持續下降，推測是細胞處于接種后高鹽狀態，生長受到抑制，需持續以糖類為供能物質，培養4 d后呈上升趨勢，藻細胞出現補償性生長效應，藻細胞可溶性總糖含量上升，且藻細胞增加糖類合成可維持細胞滲透壓穩定，是藻類應對鹽度環境改變的一種生理調節反應[24-25]。

2.4 不同鹽度條件下威氏海鏈藻可溶性蛋白含量

如圖5所示，鹽度35組培養6 d時可溶性蛋白質量濃度顯著高于其他實驗組（P＜ 0.05），均值為142.9 μg/mL，較初始值（61.28 μg/mL）增加2.3倍，且鹽度45組可溶性蛋白含量顯著低于其他實驗組 （P＜ 0.05）。

圖4 不同鹽度條件下威氏海鏈藻類總糖含量Fig.4 Total sugar content of Thalassiosira weissflogii under different salinity conditions

圖5 不同鹽度條件下威氏海鏈藻可溶性蛋白含量Fig.5 Soluble protein content of Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

在培養過程中，鹽度5組可溶性蛋白含量在0～2 d時呈現下降趨勢，2～6 d時呈現升高趨勢，而鹽度45組則在培養2～4 d時出現明顯下降，在4～8 d期間呈逐漸升高趨勢，推測這可能是威氏海鏈藻細胞應對低鹽和高鹽的不同策略。當外界鹽度過高或過低時，藻細胞滲透壓發生改變，細胞短期大量積累脯氨酸[26]、牛磺酸[27]等滲透保護劑、硫代甜菜堿（dimethylsulfoniopropionate，DMSP）[28]等有機硫化合物以及其他氨基酸以維持細胞內環境的相對穩定，抵消滲透脅迫[29-30]。研究表明，隱秘小環藻（Cyclotella cryptica）藻細胞內游離脯氨酸濃度增加是緩解高滲透脅迫的主要機制[31-32]，細胞內脯氨酸積累在穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒及作為能量庫調節細胞氧化還原勢等方面有重要作用[33]，滲透脅迫可誘導小環藻（Cyclotella nana）甘氨酸甜菜堿和DMSP合成，且該誘導在轉錄本和蛋白水平上均受到調控[34-35]。

2.5 不同鹽度條件下威氏海鏈藻中性脂含量

如圖6所示，實驗期間各組中性脂含量均呈上升趨勢。鹽度5組，培養 2～6 d時，中性脂熒光強度明顯高于其他實驗組（P＜ 0.05），鹽度45組，培養4～8 d時中性脂的積累速度高于其他實驗組（P＜ 0.05），培養8 d時中性脂熒光強度平均值達到最高，較初始熒光強度增加4倍，且顯著高于鹽度15和鹽度25組（P＜ 0.05）。推測鹽度45組藻細胞培養0～4 d時處于接種后的恢復期，細胞處于高鹽環境，增長速度慢，培養4～8 d，細胞持續受到高鹽脅迫，中性脂積累速度加快。梁英等[36]對硅藻在不同鹽度下脂肪酸組成的研究表明，硅藻主要脂肪酸為中性脂質，分別為16:0、16:1(n-7)和20:5(n-3)，隨著鹽度增加，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和新月菱形藻（Nitzschia closterium）單不飽和脂肪酸增加，纖細角毛藻（Chaetoceros gracilis）和細柱藻（Cylindrotheca fusiformis）單不飽和脂肪酸減少。鹽度對微藻中性脂含量有顯著影響[37]。宮鈺瑩 等[38]研究表明，高鹽環境使鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）細胞生長受到抑制，進而積累中性脂肪儲能。魏東等[39]研究發現，鹽度升高可顯著促進膠球藻（Coccomyxa subellipsoidea）C-169中性脂質積累。所以，鹽度變化可導致藻細胞中性脂質的積累。

圖6 不同鹽度條件下威氏海鏈藻中性脂含量Fig.6 Neutral lipid content of Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

3 結論

本研究探究威氏海鏈藻對不同鹽度環境的短期響應。結果表明，不同鹽度對威氏海鏈藻生長和生化組分有顯著影響，鹽度為15～35時，威氏海鏈藻生長速度較快，生化組成較為穩定，鹽度15時最有利于藻細胞葉綠素a和類胡蘿卜素、總糖的合成，鹽度25和鹽度35時，藻細胞平均增長速度較快，鹽度35時最有利于藻細胞可溶性蛋白積累。研究結果將為進一步開發威氏海鏈藻在對蝦養殖環境水質調控方面的應用提供參考。