腦紅蛋白與腫瘤的研究進(jìn)展＊

趙 晶，李彥榮

（1.定西市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅 定西 743000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)定西分校，甘肅 定西 743000）

1 Ngb 的基本特征

Ngb 在體內(nèi)主要以單體形式存在，也有部分多聚體形式。單體的Ngb 與Mgb 非常相近，含有151個(gè)氨基酸的單鏈，相對(duì)分子量為17000；但與Mgb 和Hgb 五配體結(jié)構(gòu)不同，Ngb 主要以脫氧亞鐵的六配體形式存在[1]。盡管Ngb 與Mgb、Hgb 的氨基酸序列同源性很低（＜25%），但具有功能特征的氨基酸折疊結(jié)構(gòu)都是一致。頻譜測(cè)定重組發(fā)現(xiàn)六配位Ngb 的結(jié)合形式為His-Fe2+-His，氧和一氧化碳可以替換內(nèi)源性蛋白配體與Ngb 結(jié)合。Ngb 與氧和一氧化碳有較高的結(jié)合率和較低的解離率，半飽和氧分壓約為P50=0.266 kPa，高于肌紅蛋白的（P50=0.133 kPa）而低于血紅蛋白（P50=3.458 kPa）[2]。所以，Ngb 更有利于組織在血氧濃度很低時(shí)增加對(duì)氧的攝取能力。但同時(shí)Ngb 又容易自我氧化，F(xiàn)e2+轉(zhuǎn)變成Fe3+，導(dǎo)致結(jié)合氧的能力受限。

作為一種攜氧球蛋白，Ngb 主要分布于耗氧量高的神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)。僅有體重2%的大腦耗氧量占到全身的20%以上，Ngb mRNA 廣泛地表達(dá)于腦組織中，Ngb 蛋白在腦組織中的濃度為1 μmol/L，占全腦組織總蛋白含量的0.01%，主要分布在大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦、嗅球和小腦；視網(wǎng)膜是人體中耗氧量最大的神經(jīng)組織，Ngb 蛋白濃度更是達(dá)100μmol/L，占全視網(wǎng)膜總蛋白量的2%～4%，Ngb mRNA 表達(dá)在視網(wǎng)膜三級(jí)神經(jīng)元（感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)段、外核層、內(nèi)核層、節(jié)細(xì)胞層），而Ngb 蛋白分布于視網(wǎng)膜色素上皮層、感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)段、外叢狀層、外核層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)外叢狀層是耗氧量高的突觸連接區(qū)域[3]，提示Ngb 參與了視覺(jué)形成和傳遞中的高耗氧程序。另外，報(bào)道在正常的腦垂體、胰腺、腎上腺和睪丸組織中有低水平的Ngb 存在，但在肝、心、橫紋肌、肺、小腸、腎和血管中均未發(fā)現(xiàn)[4]。

Ngb 雖然與組織耗氧尤其是神經(jīng)組織耗氧密切相關(guān)，但它的具體功能一直處于爭(zhēng)論和研究之中。亞細(xì)胞定位Ngb 多集中于線粒體周圍，說(shuō)明Ngb 很可能促進(jìn)氧向神經(jīng)元線粒體的擴(kuò)散，或直接介導(dǎo)氧向神經(jīng)元線粒體的傳遞，供給線粒體產(chǎn)能，從而滿足神經(jīng)細(xì)胞活躍的需氧代謝需求。但是，Ngb 蛋白在正常腦組織中的濃度太低難以發(fā)揮像Mgb（肌肉中肌紅蛋白的含量為100～400μmol/L）一樣的儲(chǔ)氧、供氧作用[5]，即使視網(wǎng)膜中濃度較高，但從Mgb 分離氧也同樣困難。因此，像Mgb 和Hgb 那樣給正常組織供氧不太可能是Ngb 的主要功能。

2 Ngb 在腫瘤中的表達(dá)

雖然大多數(shù)研究表明Ngb 在正常組織中存在于神經(jīng)元而非神經(jīng)膠質(zhì)，但Chen 等報(bào)道從新生老鼠大腦中分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到Ngb mRNA 和蛋白質(zhì)，并且Ngb 和GFAP 雙抗免疫染色呈陽(yáng)性表達(dá)[6]；在腦外傷、腦型瘧和自身免疫性腦病的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)Ngb 表達(dá)在神經(jīng)元以外的反應(yīng)性增生的膠質(zhì)細(xì)胞。這些結(jié)果表明，在某些病理?xiàng)l件下Ngb 可以出現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的主要影響人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤中星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生的發(fā)病率在80%～85%。Qin 等通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和免疫熒光法發(fā)現(xiàn)Ngb 存在于大鼠星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系(C6)、人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U251)，免疫印跡顯示目標(biāo)分子量與Ngb 相同，并使用免疫組化方法在人星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤標(biāo)本中檢測(cè)到Ngb 表達(dá)[7]。GBM 是成人最主要的惡性腦組織腫瘤，Emara 等在7 種人類GBM 細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了Ngb mRNA 和蛋白。GBM雖然被列為神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤，但其細(xì)胞起源尚不清楚，GBM 細(xì)胞可以共同表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)的標(biāo)記[8]，并且有證據(jù)表明神經(jīng)干細(xì)胞惡性分化可能發(fā)展為GBM 腫瘤[9]，因此，原本存在于神經(jīng)元的Ngb 出現(xiàn)在GBM 細(xì)胞也似乎不意外了。

研究發(fā)現(xiàn)Ngb 開(kāi)始出現(xiàn)于神經(jīng)干細(xì)胞分化時(shí)期[10]，神經(jīng)干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞有諸多相似的特征。Fordel 等使用RT-PCR 和免疫組化技術(shù)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)Ngb mRNA 和Ngb 蛋白[11]。這些研究結(jié)果提示與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的腫瘤都有可能表達(dá)Ngb。

Emara 等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在所有人類腦部腫瘤都檢測(cè)到Ngb[12]，包括I-IV 級(jí)星型細(xì)胞瘤和室管膜細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤和少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤。并且在腫瘤切片顯示了Ngb 的三種染色模式：（1）均勻一致的表達(dá)在整個(gè)實(shí)性組織；（2）細(xì)胞染色陽(yáng)性區(qū)域在陰性或弱染色組織中間；（3）染色濃密的核心區(qū)域是強(qiáng)陽(yáng)性的焦點(diǎn)所在。在個(gè)體腫瘤切片中，Ngb 的表達(dá)水平通常是腫瘤中比其匹配正常組織中有所增加。

Urszula 發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 中Ngb mRNA 呈陽(yáng)性表達(dá)，而且腫瘤組織比鄰近的正常肺組織中的表達(dá)要顯著的多[13]，這與Emara 研究結(jié)果一致；實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞株panel 分析，發(fā)現(xiàn)Ngb表達(dá)水平最高的是兩個(gè)有神經(jīng)內(nèi)分泌表型的SCLC細(xì)胞系；但是在上皮組織和其相應(yīng)的惡性組織中沒(méi)有檢測(cè)到Ngb mRNA 表達(dá)。而不同的情況出現(xiàn)在人肝癌樣本中，與相鄰的非腫瘤組織和正常肝組織相比，腫瘤組織的Ngb mRNA 和蛋白表達(dá)明顯降低。造成這一矛盾結(jié)果的原因可能是樣本太少、試驗(yàn)方法未標(biāo)準(zhǔn)化，也可能是Ngb 在不同類型的腫瘤中發(fā)揮的作用并不一致。

3 Ngb 在腫瘤中的功能

3.1 氧載體功能

因?yàn)镹gb 保留了Hb 和Mb 球蛋白折疊的所有特征（雖然氨基酸序列與Hb 或Mb 相似性極小），顯示出很高的氧和一氧化氮的親和力，所以猜測(cè)它具有氧載體功能，可能作為類似Mb 存儲(chǔ)氧運(yùn)輸氧，從而促進(jìn)氧分子擴(kuò)散到線粒體。在胞瘤組織中，新生微血管的數(shù)量往往難以滿足生長(zhǎng)快速而混亂的腫瘤細(xì)胞的耗氧量，所以缺氧微環(huán)境是人類腫瘤的一個(gè)基本特征，因此適應(yīng)低氧狀況是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)至關(guān)重要的步驟。根據(jù)Ngb 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)推測(cè)，能夠結(jié)合氧的Ngb 在腫瘤組織中可能通過(guò)存儲(chǔ)氧或運(yùn)輸氧來(lái)維持腫瘤細(xì)胞的迫切需要。在研究的大多數(shù)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Ngb 上調(diào)是其有力證據(jù)。但在正常組織中，由于血供充足而Ngb 濃度低、氧親和力比Mb 低使其儲(chǔ)氧攜氧的功能對(duì)于機(jī)體并不重要。

3.2 ROS 清道夫功能

SUN 第一次證明了Ngb 的神經(jīng)保護(hù)作用，通過(guò)抑制Ngb 表達(dá)可以減少缺氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，而Ngb 超表達(dá)可以促進(jìn)該類細(xì)胞的生存。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)Ngb 蛋白質(zhì)表達(dá)增加或降低，過(guò)氧化氫水平被發(fā)現(xiàn)相應(yīng)更低或更高；更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在缺氧或合并低糖時(shí)Ngb 表達(dá)上調(diào)，顯示對(duì)神經(jīng)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用；基于Ngb的分布特征——集中于耗氧量高的神經(jīng)區(qū)域（腦和眼）和細(xì)胞中靠近線粒體而自身儲(chǔ)氧攜氧能力有限的情況分析，Ngb 可能在病理組織清除活性氧或氨基產(chǎn)物中發(fā)揮了重要作用；關(guān)于遺傳鐵蛋白病變的研究支持了這個(gè)功能假定，Ngb 作為一個(gè)積極的游離基清除劑，在Fe-NO 形式中Ngb 超過(guò)Hb 更快與過(guò)氧化硝酸鹽反應(yīng)[14]，并且與Hb 和Mb 不同，與過(guò)氧硝酸鹽和過(guò)氧化氫的反應(yīng)沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)胞毒性產(chǎn)物，有利于細(xì)胞生存。

3.3 信號(hào)感受器功能

Ngb 天生具有結(jié)合氧的裝置，可以作為一個(gè)組織細(xì)胞的氧感受器發(fā)揮作用。Ngb 的結(jié)合端不僅可以連接氧也可以連接信號(hào)蛋白，比如異源三聚體G蛋白的亞基、14-3-3 蛋白、細(xì)胞色素C[15]。Ngb 與這些蛋白的反應(yīng)會(huì)受缺氧條件的控制，但其中機(jī)理尚不清楚。在腫瘤細(xì)胞中Ngb 可能出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，上調(diào)意味著Ngb 啟動(dòng)了缺氧反應(yīng)機(jī)制，下調(diào)可能是由于啟動(dòng)子甲基化抑制了Ngb 的表達(dá)[16]。盡管人Ngb 上游因子缺少HIF-1 等缺氧因子的接口，但Ngb 啟動(dòng)子區(qū)域包含AP-1 和NFkB 結(jié)合接口，它們的基因表達(dá)與HIF-1 的表達(dá)相關(guān)，并且兩者都已報(bào)道在缺氧時(shí)被激活；而在30.8%的非小細(xì)胞肺癌病例中Ngb 啟動(dòng)子被甲基化造成Ngb 下調(diào)，通過(guò)5-氮脫氧胞嘧啶和/或曲古抑霉素A 對(duì)肺癌細(xì)胞的影響證實(shí)了這種調(diào)節(jié)機(jī)制的存在。盡管在腫瘤組織中同時(shí)出現(xiàn)高頻的mRNA 表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化似乎是矛盾的，目前也不清楚Ngb 啟動(dòng)子甲基化是腫瘤進(jìn)展的步驟還是僅僅一個(gè)附帶的突變，但這足以說(shuō)明Ngb 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作為一種連接氧或其他信號(hào)并且可以在細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)放大信號(hào)的傳遞者。

可能具有腫瘤抑制因子功能。在體外和體內(nèi)的人類肝癌細(xì)胞系(HepG2)實(shí)驗(yàn)中[17]，強(qiáng)表達(dá)的Ngb 抑制Raf/MEK/Erk 活性，反之敲出Ngb 后Raf/MEK/Erk 活性增強(qiáng)，藥物性抑制Erk 活性則可以中止敲出Ngb 后HepG2 細(xì)胞的增殖反應(yīng)，而Ngb 的氧結(jié)合部件(H64L)突變則中止了Ngb 對(duì)Erk 活性的抑制作用。因此，認(rèn)為Ngb 通過(guò)鏈接氧/ROS 信號(hào)與致瘤Raf/ MAPK/ Erk 信號(hào)途徑而控制肝癌發(fā)展。在其他腫瘤中是否也存在類似功能有待進(jìn)一步研究。

目前，Ngb 的功能尚不完全清楚。作為一種攜氧蛋白，尤其是其在神經(jīng)組織、腫瘤組織以及在缺氧等相關(guān)病理狀態(tài)下的特殊表達(dá)，說(shuō)明Ngb 的存在十分重要。研究發(fā)現(xiàn)Ngb 在特定的組織和細(xì)胞內(nèi)功能是不同的，在惡性腫瘤，由于慢性缺氧或氧化應(yīng)激反應(yīng)，組織和細(xì)胞的新陳代謝以及關(guān)鍵信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已經(jīng)從根本上發(fā)生改變，Ngb 在腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮了比正常組織中更重要更復(fù)雜的作用。