豬NR4A1基因的多態性與產仔數性狀的關聯分析

劉林清，李慶崗，蘇世廣，周 梅，張 威，王重龍

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，豬分子數量遺傳學安徽省農業科學院重點實驗室，畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

NR4A1基因作為一個孤核受體的轉錄因子，編碼類固醇-甲狀腺激素超家族，是一類配體依賴轉錄調節蛋白[1]。有研究者指出，在卵巢粒層細胞中發現，當抑制卵巢特異的芳香化酶PII啟動子時，NR4A1基因可以抑制芳香化酶CYP19A1基因的表達[2]，并且在小鼠的黃體期檢測到NR4A1基因可以提高類固醇生成基因如20α-羥基類固醇脫氫酶在黃體中的轉錄活性[3]。NR4A1基因廣泛地在卵巢[4]、黃體[5]、大腦、腎上腺、肌肉和性腺中表達。此外還有研究者利用原位雜交方法分析認為，在注射促黃體激素（LH）/人絨毛膜促性腺激素（HCG）可誘導基因在卵巢排卵前卵泡顆粒層細胞中快速短暫的表達[6-7]。這些研究結果進一步暗示了NR4A1基因在卵巢卵泡發育及排卵過程后都發揮著作用。

為此，本研究建立了NR4A1基因的PCR-DdeIRFLP分型技術，并在3個中外豬種中進行多態性分型，還在長白豬豬群中檢測該位點的多態性并與產仔數性狀進行關聯分析，以期為提高豬產仔數提供一個有用的分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及組織采集

試驗地點在安徽省科鑫養豬育種有限公司；試驗動物：于2014年7月采集58頭淮豬、75頭長白豬及85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織放置于75%酒精的離心管中，-20 ℃保存備用；飼養管理條件和飼糧營養水平一致。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 引物的設計與合成 根據NR4A1基因DNA序列，應用Premier 5.0軟件在多態位點（第5內含子）兩側，設計一對引物，突變位點可用限制性內切酶DdeI識別，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：NR4A1基因的上游引物：5'-TTCCTCTGGGTCACAACG-3'，下游引物：5'-CTCACAGAGTCAATGCCG-3'，片段長度為128 bp，退火溫度為63.1 ℃。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系為25 μL，其中PCR 2×Taqmix 12.5 μL，10 mmol/μL的引物各0.5 μL，DNA模板1 μL（DNA約100 ng），加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為第1步95 ℃變性5 min；第2步95 ℃變性45 s；第3步62.5 ℃復性40 s；第4步72 ℃延伸35 s；重復第2至第4步35個循環，之后再72 ℃延伸10 min，最后降溫至4 ℃保存。PCR擴增產物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統中觀察，可見到片段大小為128 bp的清晰條帶。

1.2.4 限制性內切酶酶切（RFLP）NR4A1基因的PCR產物用DdeI內切酶酶切，反應體系為：10×Buffer 1 μL，DdeI酶0.30 μL（10 U/μL），加PCR產物至10 μL；37 ℃反應8～12 h；然后，酶切產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統中觀察。

1.3 數據處理分析

1.3.1 統計分析的軟件 采用SAS 8.0統計軟件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序進行標記方差分析，并進行顯著性檢驗。

1.3.2 基因效應統計分析模型 依據Liu等[8]所述方法建立的單標記回歸統計模型，除了豬個體為隨機效應以外，其他因素均為固定效應。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效應+殘差，其中Y為性狀表型值。

2 結果與分析

2.1 豬NR4A1基因的多態位點檢測

PCR擴增片段長度為128 bp，經DdeI酶切后產生3種基因型（圖1）。當多態位點為GG基因型時，則造成了DdeI酶切位點，PCR產物經DdeI消化后產生2個片段（96 bp+32 bp），記為等位基因G；當多態位點為AA基因型時，則酶切位點消失，PCR產物經DdeI消化后產生1個片段（128 bp），記作等位基因A。

圖1 豬NR4A1基因DdeI酶切分型結果

2.2 豬NR4A1基因在不同豬群體中基因型和等位基因的頻率分布

由表1可見，NR4A1基因DdeI酶切位點在所檢測的3個豬群中，均發現G等位基因占優勢。

表1 NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP基因型頻率和等位基因頻率分布

2.3 豬NR4A1基因DdeI多態位點基因型與豬產仔數性狀的關聯分析

應用基因效應統計分析模型，采用SAS統計軟件的GLM程序分別在長白豬群體中進行豬NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP多態位點與產仔數性狀的關聯分析。

在長白豬群體中，所有胎次產仔數均呈現GG>AG>AA的趨勢。其中，GG型個體和AG型個體的所有胎次產仔數分別顯著高于AA型個體（P<0.05），詳見表2。統計結果顯示，GG型母豬具有較高的產仔數，G等位基因為優勢等位基因。

表2 NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP基因型與長白豬產仔數性狀的統計分析

3 討論

淮豬是我國地方豬種，具有生長速度慢、繁殖力高等特性。長白豬是引進的外來豬種，其具有生長速度快、繁殖力不高等特性。而淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優良地方品種淮豬為母本，以國外優質瘦肉型品種長白豬、大白豬為父本，經過雜交育種組建基礎群，然后運用標記輔助選擇BLUP估計育種值進行群體繼代選育的。NR4A1基因作為一個孤核受體的轉錄因子，編碼類固醇-甲狀腺激素超家族。筆者前期采用RT-PCR方法分析豬NR4A1基因在用PMSG（孕馬血清促性腺激素）和HCG（人絨毛膜促性腺激素）處理卵巢顆粒細胞不同時間后的表達情況，研究結果表明，NR4A1基因在卵泡顆粒細胞生長、發育等過程中瞬時表達[9]，這與其他研究者的結果是一致的[6-7]。這些研究結果進一步證實NR4A1基因在卵巢卵泡發育及排卵過程后都發揮著作用。所以，我們選擇NR4A1基因作為研究豬產仔數性狀的候選基因。

本研究發現，NR4A1基因DdeI酶切位點在所檢測的3個豬群中均發現G等位基因占優勢，并且在長白豬豬群體中，所有胎次產仔數均呈現GG>AG>AA的趨勢。其中，GG型個體和AG型個體的所有胎次產仔數分別顯著高于AA型個體（P<0.05），從以上結果表明，GG型母豬具有較高的產仔數，G等位基因為優勢等位基因。因此選擇GG型個體留種可提高群體的產仔數，在今后選育中可適當提高等位基因G的頻率。