豬NR4A1基因的多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

劉林清，李慶崗，蘇世廣，周 梅，張 威，王重龍

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，豬分子數(shù)量遺傳學(xué)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

NR4A1基因作為一個(gè)孤核受體的轉(zhuǎn)錄因子，編碼類固醇-甲狀腺激素超家族，是一類配體依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白[1]。有研究者指出，在卵巢粒層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制卵巢特異的芳香化酶PII啟動(dòng)子時(shí)，NR4A1基因可以抑制芳香化酶CYP19A1基因的表達(dá)[2]，并且在小鼠的黃體期檢測(cè)到NR4A1基因可以提高類固醇生成基因如20α-羥基類固醇脫氫酶在黃體中的轉(zhuǎn)錄活性[3]。NR4A1基因廣泛地在卵巢[4]、黃體[5]、大腦、腎上腺、肌肉和性腺中表達(dá)。此外還有研究者利用原位雜交方法分析認(rèn)為，在注射促黃體激素（LH）/人絨毛膜促性腺激素（HCG）可誘導(dǎo)基因在卵巢排卵前卵泡顆粒層細(xì)胞中快速短暫的表達(dá)[6-7]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步暗示了NR4A1基因在卵巢卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程后都發(fā)揮著作用。

為此，本研究建立了NR4A1基因的PCR-DdeIRFLP分型技術(shù)，并在3個(gè)中外豬種中進(jìn)行多態(tài)性分型，還在長(zhǎng)白豬豬群中檢測(cè)該位點(diǎn)的多態(tài)性并與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為提高豬產(chǎn)仔數(shù)提供一個(gè)有用的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及組織采集

試驗(yàn)地點(diǎn)在安徽省科鑫養(yǎng)豬育種有限公司；試驗(yàn)動(dòng)物：于2014年7月采集58頭淮豬、75頭長(zhǎng)白豬及85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織放置于75%酒精的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫伙曫B(yǎng)管理?xiàng)l件和飼糧營(yíng)養(yǎng)水平一致。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NR4A1基因DNA序列，應(yīng)用Premier 5.0軟件在多態(tài)位點(diǎn)（第5內(nèi)含子）兩側(cè)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，突變位點(diǎn)可用限制性內(nèi)切酶DdeI識(shí)別，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：NR4A1基因的上游引物：5'-TTCCTCTGGGTCACAACG-3'，下游引物：5'-CTCACAGAGTCAATGCCG-3'，片段長(zhǎng)度為128 bp，退火溫度為63.1 ℃。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中PCR 2×Taqmix 12.5 μL，10 mmol/μL的引物各0.5 μL，DNA模板1 μL（DNA約100 ng），加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為第1步95 ℃變性5 min；第2步95 ℃變性45 s；第3步62.5 ℃復(fù)性40 s；第4步72 ℃延伸35 s；重復(fù)第2至第4步35個(gè)循環(huán)，之后再72 ℃延伸10 min，最后降溫至4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察，可見(jiàn)到片段大小為128 bp的清晰條帶。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切（RFLP）NR4A1基因的PCR產(chǎn)物用DdeI內(nèi)切酶酶切，反應(yīng)體系為：10×Buffer 1 μL，DdeI酶0.30 μL（10 U/μL），加PCR產(chǎn)物至10 μL；37 ℃反應(yīng)8～12 h；然后，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

1.3.1 統(tǒng)計(jì)分析的軟件 采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序進(jìn)行標(biāo)記方差分析，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.3.2 基因效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析模型 依據(jù)Liu等[8]所述方法建立的單標(biāo)記回歸統(tǒng)計(jì)模型，除了豬個(gè)體為隨機(jī)效應(yīng)以外，其他因素均為固定效應(yīng)。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效應(yīng)+殘差，其中Y為性狀表型值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬NR4A1基因的多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)

PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為128 bp，經(jīng)DdeI酶切后產(chǎn)生3種基因型（圖1）。當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)為GG基因型時(shí)，則造成了DdeI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)DdeI消化后產(chǎn)生2個(gè)片段（96 bp+32 bp），記為等位基因G；當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)為AA基因型時(shí)，則酶切位點(diǎn)消失，PCR產(chǎn)物經(jīng)DdeI消化后產(chǎn)生1個(gè)片段（128 bp），記作等位基因A。

圖1 豬NR4A1基因DdeI酶切分型結(jié)果

2.2 豬NR4A1基因在不同豬群體中基因型和等位基因的頻率分布

由表1可見(jiàn)，NR4A1基因DdeI酶切位點(diǎn)在所檢測(cè)的3個(gè)豬群中，均發(fā)現(xiàn)G等位基因占優(yōu)勢(shì)。

表1 NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP基因型頻率和等位基因頻率分布

2.3 豬NR4A1基因DdeI多態(tài)位點(diǎn)基因型與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用基因效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析模型，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的GLM程序分別在長(zhǎng)白豬群體中進(jìn)行豬NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析。

在長(zhǎng)白豬群體中，所有胎次產(chǎn)仔數(shù)均呈現(xiàn)GG>AG>AA的趨勢(shì)。其中，GG型個(gè)體和AG型個(gè)體的所有胎次產(chǎn)仔數(shù)分別顯著高于AA型個(gè)體（P<0.05），詳見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，GG型母豬具有較高的產(chǎn)仔數(shù)，G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。

表2 NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP基因型與長(zhǎng)白豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

淮豬是我國(guó)地方豬種，具有生長(zhǎng)速度慢、繁殖力高等特性。長(zhǎng)白豬是引進(jìn)的外來(lái)豬種，其具有生長(zhǎng)速度快、繁殖力不高等特性。而淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優(yōu)良地方品種淮豬為母本，以國(guó)外優(yōu)質(zhì)瘦肉型品種長(zhǎng)白豬、大白豬為父本，經(jīng)過(guò)雜交育種組建基礎(chǔ)群，然后運(yùn)用標(biāo)記輔助選擇BLUP估計(jì)育種值進(jìn)行群體繼代選育的。NR4A1基因作為一個(gè)孤核受體的轉(zhuǎn)錄因子，編碼類固醇-甲狀腺激素超家族。筆者前期采用RT-PCR方法分析豬NR4A1基因在用PMSG（孕馬血清促性腺激素）和HCG（人絨毛膜促性腺激素）處理卵巢顆粒細(xì)胞不同時(shí)間后的表達(dá)情況，研究結(jié)果表明，NR4A1基因在卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程中瞬時(shí)表達(dá)[9]，這與其他研究者的結(jié)果是一致的[6-7]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)NR4A1基因在卵巢卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程后都發(fā)揮著作用。所以，我們選擇NR4A1基因作為研究豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1基因DdeI酶切位點(diǎn)在所檢測(cè)的3個(gè)豬群中均發(fā)現(xiàn)G等位基因占優(yōu)勢(shì)，并且在長(zhǎng)白豬豬群體中，所有胎次產(chǎn)仔數(shù)均呈現(xiàn)GG>AG>AA的趨勢(shì)。其中，GG型個(gè)體和AG型個(gè)體的所有胎次產(chǎn)仔數(shù)分別顯著高于AA型個(gè)體（P<0.05），從以上結(jié)果表明，GG型母豬具有較高的產(chǎn)仔數(shù)，G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。因此選擇GG型個(gè)體留種可提高群體的產(chǎn)仔數(shù)，在今后選育中可適當(dāng)提高等位基因G的頻率。