漣水縣某養(yǎng)殖場仔豬腹瀉源沙門氏菌流行病學調查及耐藥性分析

劉海軍，劉兵斌，左建新，左文兵，劉小娟，王禮偉，周 剛，張晨飛

（1.漣水縣園園家禽養(yǎng)殖有限公司，江蘇 淮安 223400；2.漣水縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇 淮安 223400；3.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所，江蘇 淮安 223000）

仔豬腹瀉是養(yǎng)殖場常見的疾病之一，主要癥狀為腹瀉、脫水、消瘦、精神萎靡等，進一步導致發(fā)病急、死亡率高、日增重降低、出欄時間延長、飼料轉化率下降、養(yǎng)殖成本增加等，給養(yǎng)殖行業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。該病主要是致病菌、腸道環(huán)境和管理之間相互作用的綜合結果，根據(jù)致病菌的不同，細菌類的可以分為埃希氏大腸桿菌、沙門氏菌、魏氏梭菌等；病毒類的如非洲豬瘟病毒、輪狀病毒、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等；寄生蟲類的如艾美耳球蟲、弓形蟲等[2]。由于細菌性腹瀉在規(guī)模化養(yǎng)豬場患病中的普遍性和重要性，為進一步了解淮安地區(qū)細菌性病原流行病學和抗生素耐藥情況，本試驗開展了細菌的分離鑒定及耐藥性工作，希望為疾病防控、減抗禁抗、食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料的來源

在2021年1月1—29日期間，采集江蘇淮安地區(qū)漣水縣園園家禽養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖場出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬糞便樣品進行統(tǒng)計分析（洋三元品種）。發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為精神不振、被毛松亂、食欲不佳、黃白色水樣糞便等。使用無菌棉簽采集發(fā)生腹瀉癥狀仔豬肛門周圍新鮮的糞便，無菌操作后放入EP管，-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗試劑 SS瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基均購自上海盛思生化科技有限公司，具體制作方法參照使用說明書。無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基的制備參考獸醫(yī)微生物學[3]。

1.2.2 藥敏紙片 選擇12種抗菌藥物紙片，包括紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

1.3 細菌的富集、分離與純化

首先將采集的仔豬腹瀉樣糞便進行細菌的富集培養(yǎng)：樣品加入5 mL MH液體培養(yǎng)基進行37 ℃下180 r/h連續(xù)搖床培養(yǎng)12 h。然后采用四區(qū)劃線法接種到SS瓊脂培養(yǎng)基上進行選擇性分離純化。挑取典型單個菌落再次富集培養(yǎng)后劃線接種到無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察菌株溶血情況，同時接種到MH液體培養(yǎng)基中備用。

1.4 革蘭氏染色鏡檢

將無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中單個菌落進行涂片、革蘭氏染色、顯微鏡油鏡下觀察菌體的形狀及染色特性。

1.5 細菌生化鑒定試驗

將待檢菌落按照伯杰氏生化鑒定手冊進行生化鑒定。

1.6 耐藥性試驗

將鑒定后的沙門氏菌菌液使用涂布器涂勻涂布MH瓊脂培養(yǎng)基上，3～5 min以后，待菌液全部干燥，均勻貼上3片不同的藥敏制品，紙片標準參考美國臨床與實驗室標準化協(xié)會（CLSI）制定的藥敏制品國際標準制作，試驗方法參照獸醫(yī)微生物學，放置溫箱培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的直徑，并根據(jù)抑菌圈的大小判斷對抗菌藥的敏感性[4]。

1.7 腹瀉發(fā)病率、沙門氏菌分離率的流行病學調查

針對豬場腹瀉發(fā)病情況進行調查統(tǒng)計，結合后期沙門氏菌的分離鑒定，再次分析沙門氏菌感染的流行病學情況。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化結果

累計采集樣品120份，對樣品進行富集、分離、純化，疑似沙門氏菌在SS瓊脂上長出乳白色、圓形、邊緣整齊、光滑、表面有隆起、中間有針狀黑點的小菌落（圖1），在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán)（圖2）；革蘭氏染色、鏡檢結果顯示，疑似沙門氏菌為無序的、無莢膜、無芽孢、革蘭氏陰性短小直桿菌（圖3），最終分離純化疑似沙門氏菌86株。

圖1 沙門氏菌在SS瓊脂上菌落形態(tài)

圖2 沙門氏菌在兔血瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖3 沙門氏菌革蘭氏染色鏡檢結果（1 000×）

2.2 細菌生化鑒定結果

利用分離純化后的疑似沙門氏菌進行生化鑒定，最終86株全部能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應陰性，MR反應陽性，VP反應陰性，檸檬酸鹽反應陽性，三糖鐵斜面產(chǎn)堿、底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫，符合沙門氏菌的生化特性。最終確定分離鑒定得到86株沙門氏菌，樣品分離率為71.67%（86/120）。

2.3 細菌耐藥性試驗結果

對86株沙門氏菌進行藥敏試驗，對林可霉素的耐藥株數(shù)比例最高為93.02%（80/86），且對青霉素、克林霉素以及多西環(huán)素的耐藥株數(shù)比例均高于80%，而對慶大霉素、氧氟沙星高度敏感，敏感株數(shù)比例高于65%，青霉素的中敏毒株數(shù)為0（0/0），見表1。

表1 12種抗菌藥物對86株沙門氏菌耐藥性試驗結果

2.4 細菌多重耐藥結果

多重耐藥結果顯示，86株沙門氏菌存在4～10種耐藥數(shù)類型，主要集中在6、7、8、9種耐藥數(shù)類型，其中耐8種抗生素的菌株比例最高為29.07%（25/86），耐4種抗生素的菌株比例最低為4.65%（4/86），見圖4。

圖4 分離菌株多重耐藥性分析

2.5 腹瀉流行病學調查結果

對該豬場的流行病學調查發(fā)現(xiàn)，豬場仔豬存欄數(shù)目共2 862頭，在試驗期29 d內，采集到樣品的天數(shù)為25 d，累計取樣120份，最終分離鑒定沙門氏菌86株。最終統(tǒng)計采集到樣品天數(shù)與調查總天數(shù)比例為86.21%（25/29），仔豬群體腹瀉發(fā)病率為4.19%（120/2 862），沙門氏菌分離率為3.00%（86/2 862），腹瀉情況下沙門氏菌的分離率為71.67%（86/120）。

3 討論與結論

自2018年非洲豬瘟在我國沈陽暴發(fā)以來，2019年我國生豬出欄54 419萬頭，同比下跌21.6%，存欄31 041萬頭，同比下跌27.5%，隨著牧原、溫氏等各大養(yǎng)殖集團的產(chǎn)能恢復，2020年生豬的市場供應會進一步增加[5]。腹瀉是豬場仔豬常見的傳染病之一，而豬沙門氏菌病則是由沙門氏菌引起，急性者為敗血癥，慢性者為壞死性腸炎，常發(fā)生于6月齡以下仔豬，特別是2～4月齡仔豬多見，一年四季均可發(fā)生，寒冷、多雨潮濕、季節(jié)交替時發(fā)病率高，養(yǎng)殖管理人員需要高度重視該病的流行規(guī)律。本試驗累計取樣120份，最終分離鑒定沙門氏菌86株，仔豬群體腹瀉發(fā)病率為4.19%，腹瀉情況下沙門氏菌的分離率為71.67%，而針對淮安區(qū)域關于生豬沙門氏菌流行病學的調查和藥敏紙片試驗研究較少，無法進行比較分析。在其他地區(qū)，李晨等[6]從貴州地區(qū)7個養(yǎng)殖場128份仔豬腸道樣本中發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的分離率為16.41%（21/128），因為研究方法與本試驗不同，導致分離率存在較大差異；曲歌等[7]在吉林地區(qū)21家規(guī)模化豬場117份仔豬腹瀉糞便樣本中進行PCR檢測，分離出沙門氏菌19份，其中15份具有致病性，致病性高達78.95%，這進一步說明了不同地區(qū)沙門氏菌較高的致病性。在細菌的耐藥性試驗上，馬梓承等[8]在山東泰安市某自繁自養(yǎng)豬場研究發(fā)現(xiàn)分離的沙門氏菌對慶大霉素具有耐藥性、對左旋氧氟沙星高度敏感，研究結果與本次試驗結果不同，還需要進一步研究。

鑒于沙門氏菌在自然界的普遍性與致病性，對畜禽健康、人類公共安全、食品安全都有嚴重的影響，因此在豬沙門氏菌病的防控措施上，疫苗依舊是防控疫病最重要的手段。王偉[9]建議制定合理的疫苗免疫方案，提前免疫接種豬沙門氏菌疫苗，如國內普遍使用的C500株沙門氏菌弱毒苗，在妊娠母豬、仔豬特定階段進行首免、二免等。而除了疫苗的預防外，利用呋喃類、磺胺類和喹諾酮類抗生素，如利用諾氟沙星，配合選用大蒜進行混合飼喂治療，連續(xù)使用25～50 g/（頭·d），具有較好的治愈效果[10]。楊樹皎[11]發(fā)現(xiàn)由于臨床上沙門氏菌極易產(chǎn)生耐藥性，故不建議采用抗生素低劑量長期預防用藥，可以采用免疫增效劑或者添加倍量的維生素進行預防，利用止痢舒（主要成分：雄黃、藿香、滑石、苦參等）混飼治療，從生物學角度進行防控。另外，需要加強畜禽飼料、飲水的質量管理，食槽、圈舍、水嘴等設備設施的清洗消毒，嚴格執(zhí)行養(yǎng)殖企業(yè)的各項管理規(guī)則制度，提高管理人員和飼養(yǎng)人員的生物安全意識[12]。

本次研究發(fā)現(xiàn)漣水縣某豬場仔豬沙門氏菌導致腹瀉的發(fā)病率為3.00%，致病菌樣品中沙門氏菌的分離率為71.67%。分離鑒定的沙門氏菌對青霉素、林可霉素、克林霉素以及多西環(huán)素的耐藥株數(shù)比例高達80%，而對慶大霉素、氧氟沙星的敏感株數(shù)比例高達65%，同時耐8種抗生素的菌株比例最高為29.07%（25/86），此研究結果對沙門氏菌病綠色、安全、高效的防治提供一定參考。