一例混合感染豬病病原的實驗室檢測

李 斌，秦毅斌，盧冰霞，何 穎，段群棚，梁家幸，陳忠偉，周英寧，蔣冬福，盧敬專，全琛宇，許心婷，趙 碩，楊思儀，趙 平，3，趙 武

（1.廣西獸醫研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；3.廣西大學，廣西 南寧 530004）

2018年5月，廣西某縣某豬場突然有70多頭35日齡豬發病，病豬癥狀為消瘦、腹瀉、氣喘、腹式呼吸，其中20多頭豬病死。病死豬剖檢病變為淋巴結腫大、出血；肺充血、出血，與胸膜粘連；肝充血；脾有梗死點；腎充血，表面有散在的出血點；膀胱黏膜有散在的出血點。應用抗生素對病豬進行治療無效。該豬場將其中5頭病死豬每頭分別采取淋巴結、肺、肝、脾、腎等病料送實驗室檢測。據該豬場人員反映的病豬發病情況及病豬剖檢病變，初步懷疑該豬場所發疫病病原為豬圓環病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬肺炎支原體（MHP），于是應用本實驗室所建立的PCR/RT-PCR方法對送檢病料進行上述疑似豬病病原的檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料樣品 將該豬場送檢的5頭病死豬的淋巴結、肺、肝、脾、腎等臟器分別混合研磨，依次編號為1、2、3、4、5。

1.1.2 試驗試劑 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學（吳江）有限公司；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；Golden Easy PCR System（含染料，雙組份）購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL 2 000購自Takara生物技術有限公司。

1.1.3 試驗儀器 杭州晶格T960梯度PCR儀；北京六一廠電泳儀。

1.1.4 檢測用PCR引物 檢測所用PCR引物見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，均用ddH2O配制成25 μmol/L工作濃度。

表1 檢測所用的PCR引物

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 分別剪取送檢5份病料的淋巴結、肺、肝、脾、腎的病變與正常交界部分，將每頭病死豬的這5種器官病料混作1份樣品進行檢測，共檢測5份樣品。將樣品充分研磨，凍融3次，10 000 r/min離心3 min，取上清液備用。

1.2.2 檢測樣品核酸的提取 取上述處理好的樣品離心上清液200 μL，按照RNA/DNA提取試劑盒說明書操作步驟，進行病毒核酸的提取，所得病毒核酸供RT或PCR檢測用。其中，應用RT-PCR方法檢測CSFV、PRRSV；應用PCR方法檢測PCV2、PRV、MHP。

1.2.3 反轉錄（RT）

（1）RT反應體系。將樣品RNA反轉錄合成cDAN：按照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明進行，采用20 μL反應體系：5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L each）4 μL，DTT（0.1 M）2 μL，Primer Mix 2 μL，HiFiScript（200 U/μL）1 μL，RNA模板7 μL。

（2）RT反應反應條件。按以下程序進行反轉錄反應：42 ℃ 50 min，4 ℃保存。

1.2.4 PCR反應 應用PCR檢測引物（上游引物F、下游引物R）分別對病料樣品核酸進行5種病原的PCR擴增反應，這5種病原PCR擴增反應同時在同一臺梯度PCR儀上進行不同退火溫度的擴增反應。

（1）PCR反應體系。25 μL PCR反應體系為：雙蒸H2O 9 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（F、R）各0.5 μL，DNA模板2.5 μL。

（2）PCR反應條件。94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，梯度退火溫度：PCV2 56 ℃/CSFV 55 ℃/PRRSV 57 ℃/PRV 63 ℃/MHP 56 ℃，復性45 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.5 電泳觀察結果 多重PCR反應結束，取10 μL多重PCR擴增產物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結束于凝膠成像系統中觀察結果，并拍照保存。

2 結果與分析

2.1 PCR產物電泳結果

PCR產物電泳結果見圖1。

圖1 部分病料樣品及對照檢測結果

2.2 送檢病料5種病原的檢測結果

在檢測的5份病料樣品中，CSFV、PRRSV二重感染率為60%（3/5），PCV2、CSFV、PRRSV三重感染率為20%（1/5），見表2。

表2 5份病料檢測5種病原的檢測結果

3 討論與分析

3.1 本次檢測針對不同的DNA/RNA病原，應用DNA/RNA核酸抽提試劑盒一次同時提取病料樣品的總核酸（DNA/RNA）；應用相同的PCR/RT反應體系；應用除了不同病原對應不同退火溫度之外，其余均相同的PCR反應條件。這種方便快捷的核酸提取方法及梯度退火溫度PCR檢測方法非常適合獸醫臨床病料樣品中多種病原混合感染的快速檢測。這種在同一臺梯度PCR儀上應用不同退火溫度同時擴增檢測多種病原核酸的PCR檢測方法，較之在同一PCR反應管中應用不同引物的多重PCR檢測方法要簡便易行，方法設計、優化難度低[1-2]。

本次檢測針對P CV2、C SF V、PR R SV、PRV、MHP這5種常見豬病病原分別設計合成5對P CR擴增引物，根據5對引物不同的退火溫度，在同一臺梯度PCR儀上同時進行5份送檢病料中的5種病原共25個樣品的檢測，結果檢測出二重感染（CSFV+PRRSV）、三重感染（PCV2+CSFV+PRRSV）的病料。

3.2 本次檢測的5份病料樣品中，CSFV、PRRSV二重感染率為60%（3/5），PCV2、CSFV、PRRSV三重感染率為20%（1/5），說明該送檢豬場豬只存在混合感染情況。目前豬病多發，其中混合感染病例較為常見，尤其是PCV2、CSFV、PRRSV等常見病原混合感染的豬病時有報道[3-9]。所以在防制單一豬病的同時要注意多重混合感染豬病的防制，豬場要應用多種疫苗或多聯疫苗對多種豬病進行同時免疫預防。

3.3 根據檢測結果，建議送檢豬場采取如下防制措施：1）PCV2、PRRS均為豬免疫抑制性疫病，若發生這兩種豬病，將會破壞病豬的免疫系統，導致免疫功能障礙，致使病豬機體免疫系統對疫苗的免疫應答反應水平下降，從而導致疫苗的免疫保護效果不理想，例如，豬只免疫力低下，造成免疫過的豬群發生非典型豬瘟[10]。這對豬場的危害尤為嚴重，所以要重點加強對PCV2、PRRS這兩種豬免疫抑制性疫病的監測與防控。2）本次檢測所用PRRSV引物根據PRRSV的Nsp基因設計，可以鑒別區分PRRSV經典毒株（預期擴增片段大小為320 bp）和PRRSV高致病變異毒株（預期擴增片段大小為230 bp），此次所檢病料樣品的PRRSV PCR擴增產物大小為230 bp，所以可以推斷該送檢豬場所發PRRS疫病是由PRRSV高致病變異毒株導致的。我國已發現PRRSV Nsp2的變異主要表現在氨基酸的缺失[11-14]，此次發現的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征就是由Nsp2缺失30個氨基酸的變異株引起的。PRRSV的基因容易發生變異，從而導致疫苗免疫失敗，所以建議送檢豬場對本場病豬的PRRSV進行基因測序，然后將測序結果序列與NCBI GenBank網站上的PRRSV參考毒株的相應基因序列進行遺傳進化同源性比對，然后選擇同源性最為接近的廠家PRRSV毒株疫苗進行免疫，以確保疫苗免疫的有效性。