一株致仔豬腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

大腸桿菌是自然界中一種常見的革蘭氏陰性菌，也是豬只腸道常在菌[1]，血清型眾多，致病性大腸桿菌能夠產(chǎn)生毒素及黏附因子，可引起豬多種疾病[2]。由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的黃痢、白痢是一種仔豬常見腹瀉性疾病[3]，臨床表現(xiàn)為仔豬水樣腹瀉、消瘦、嚴(yán)重脫水等，發(fā)病急，死亡率高。大腸桿菌性腹瀉在養(yǎng)豬場(chǎng)普遍存在，豬場(chǎng)一旦有發(fā)生就很難根除，發(fā)病豬即使有耐過，也會(huì)嚴(yán)重影響生長(zhǎng)，飼料轉(zhuǎn)化率降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4]。由于抗生素在豬場(chǎng)的濫用，大腸桿菌耐藥性顯著增加[5]，常規(guī)藥物治療效果不理想，反而加重豬只各器官組織負(fù)擔(dān)，加速死亡進(jìn)程，因此，對(duì)臨床分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出最佳藥物，以便采取針對(duì)性治療措施，提升防控效果。

2020年9月山東濱州某規(guī)?；i場(chǎng)，7日齡內(nèi)仔豬發(fā)生腹瀉，同窩仔豬發(fā)病率約為60%，病死率高達(dá)80%。同窩仔豬中先有個(gè)別仔豬發(fā)病，表現(xiàn)厭食、腹瀉，后其他仔豬相繼發(fā)生腹瀉，排出黃色水樣糞便，乳豬迅速消瘦、脫水、昏迷死亡。剖檢可見胃內(nèi)乳汁凝固不全，乳糜管內(nèi)有脂肪。腸黏膜充血，腸壁水腫，腸內(nèi)充盈液體和氣體。經(jīng)用青霉素、慶大霉素、紅霉素藥治療但未見明顯好轉(zhuǎn)。臨床采集發(fā)病豬肝臟、脾臟、腸道等組織送魯北獸醫(yī)診斷中心進(jìn)行確診。最終分離和鑒定了一株致病性大腸桿菌，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與試驗(yàn)動(dòng)物

麥康凱瓊脂購自青島海博生物；革蘭氏染色液草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復(fù)紅染液等由山東綠都生物質(zhì)量監(jiān)察部提供；DL 2 000 Marker、rTaq購自寶生物工程（大連）有限公司。藥敏紙片、糖發(fā)酵管及生化試驗(yàn)用各種試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、輪狀病毒三重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒和豬德爾塔冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒均由山東綠都生物科技有限公司動(dòng)物疫病檢測(cè)事業(yè)部研制。致泄型大腸桿菌菌體抗原（O）診斷血清購自天津生物芯片生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。18～25 g清潔級(jí)昆明系小鼠10只，購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 引物

根據(jù)Gen Bank中登錄的大腸桿菌16SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，下游引物：5′-CGTCATCCCCACCTTCCTC-3′，目的基因序列為1 091 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 腹瀉性病毒RT-PCR檢測(cè)

按照Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒說明書操作提取樣品中病原核酸，采用豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、輪狀病毒三重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒和豬德爾塔冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒和豬德爾塔冠狀病毒。

1.4 細(xì)菌染色鏡檢與分離培養(yǎng)

用采集的發(fā)病豬肝臟、脾臟等病料樣本觸片、干燥固定，革蘭氏染色、顯微鏡下觀察。病料無菌條件下劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取紅色中等大小光滑菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，置200 r/min搖床中37 ℃振搖培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)液0.1 mL涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)平板，染色、鏡檢。

1.5 生化試驗(yàn)

將分離菌純培養(yǎng)液，接種于葡萄糖、乳糖等糖發(fā)酵管及其他生化管中進(jìn)行生化試驗(yàn)，恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.6 PCR鑒定

取分離菌純培養(yǎng)液200 μL，95 ℃恒溫金屬浴10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液做模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：PCR反應(yīng)預(yù)混液rTaq 10 μL，上、下游引物各1 μL（15 pmol/L），模板1 μL，加純化水補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物3 μL于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.7 藥敏試驗(yàn)

取滅菌棉簽，無菌操作蘸取分離菌純培養(yǎng)液，均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，置37 ℃培養(yǎng)箱數(shù)分鐘直至瓊脂表面無明顯液體時(shí)貼藥敏紙片。用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕緊貼于瓊脂上，使得紙片按照梅花狀分布，紙片間距離適當(dāng)，置37 ℃培養(yǎng)16 h后觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑大小并記錄數(shù)據(jù)。

1.8 抗原血清型鑒定

取分離菌純培養(yǎng)液121 ℃下高壓2 h，作為待檢抗原。分別吸取待檢抗原和大腸桿菌O抗血清各10 μL，在玻片上混合均勻，同時(shí)以生理鹽水作陰性對(duì)照，觀察并記錄反應(yīng)結(jié)果，2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者判為陽性，否則為陰性。

1.9 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

取健康昆明系小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組和對(duì)照組各5只，取分離菌純培養(yǎng)液腹腔注射試驗(yàn)組小鼠，0.2 mL/只，對(duì)照組注射生理鹽水，同樣0.2 mL/只，觀察小鼠發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉性病毒RT-PCR檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果顯示，病料中豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和豬德爾塔冠狀病毒核酸均為陰性。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

組織觸片染色鏡檢可見兩端鈍圓紅色桿狀細(xì)菌。麥康凱瓊脂平板劃線分離培養(yǎng)后，可見光滑、濕潤(rùn)、紅色小菌落，直徑2～3 mm。挑取單菌落，經(jīng)涂片、革蘭氏染色，干燥，鏡檢可見形態(tài)均一，兩端鈍圓、革蘭氏陰性、中等大小的桿狀細(xì)菌。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

該大腸桿菌分離株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖、鼠李糖、山梨醇，不能發(fā)酵衛(wèi)矛醇、赤鮮醇、肌醇、菊糖，MR試驗(yàn)、吲哚、靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，VP試驗(yàn)、硫化氫、構(gòu)椽酸鹽、尿素酶試驗(yàn)陰性，符合大腸桿菌的生化特征（表1）。

表1 分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 091 bp，符合預(yù)期結(jié)果。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示與大腸桿菌16S rRNA基因的同源性為100%。

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），分離菌對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林高度敏感，對(duì)青霉素G、氟苯尼考、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星等表現(xiàn)不同程度耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.6 血清型鑒定結(jié)果

血清分型試驗(yàn)結(jié)果顯示，所分離大腸桿菌O抗原血清型為O149。

2.7 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

昆明小鼠腹腔接種純培養(yǎng)分離菌液5 h后開始出現(xiàn)精神委靡、食欲不振，同時(shí)伴有站立不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，最終死亡，48 h內(nèi)小鼠全部死亡。剖檢可見肝、脾腫大和肺出血，腸管腫脹、出血，腸內(nèi)充滿黃色液體。無菌采集肝臟接種麥康凱瓊脂平板，過夜培養(yǎng)后，挑單菌落，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性小桿菌。對(duì)照組小鼠健活，剖殺后無菌采集肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果未分離到細(xì)菌。

3 討論

豬腹瀉性疾病是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的最重要的一類疾病，引起豬腹瀉原因包括細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲性，以及環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)因素等。豬發(fā)生腹瀉后一定要查找原因，盡快確診，從而采取相應(yīng)措施，不能憑主觀判斷隨意治療，延誤病情，可能會(huì)造成大損失。隨著全面禁抗時(shí)代的來臨，豬場(chǎng)細(xì)菌病發(fā)生有抬頭趨勢(shì)，豬場(chǎng)一定要重視細(xì)菌病防控，本案例豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉初次抗生素治療不見效果后，懷疑為病毒感染所導(dǎo)致腹瀉，錯(cuò)過疾病治療時(shí)機(jī)，豬場(chǎng)造成一定損失。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷排除了一些常見的病毒性疾?。ㄘi流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒病和德爾塔冠狀病毒?。?，進(jìn)一步細(xì)菌分離鑒定后確診大腸桿菌為引起豬腹瀉的病原。因此，豬場(chǎng)遇到類似問題時(shí)，應(yīng)及早送相關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷排查，確定病因后才針對(duì)性的采取治療措施。

大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為O抗原、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中根據(jù)O抗原對(duì)大腸桿菌進(jìn)行血清型分型，至今已發(fā)現(xiàn)170多種血清型。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，所感染大腸桿菌血清型為O149，與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的不同地區(qū)分離的豬源性大腸桿菌的血清型有一定的差異性。要選取未經(jīng)抗生素治療的豬只，無菌采集相應(yīng)組織器官，進(jìn)行細(xì)菌分離，病料保證新鮮，低溫保存運(yùn)輸。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，本病例所分離大腸桿菌對(duì)豬場(chǎng)常用抗生素青霉素G、氟苯尼考、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星表現(xiàn)出不同程度耐藥，分析原因可能為豬場(chǎng)長(zhǎng)期不規(guī)范、不科學(xué)的抗生素使用促使細(xì)菌在藥物壓力下產(chǎn)生耐藥質(zhì)粒所致，或所感染菌本身為耐藥菌，今后豬場(chǎng)在防控豬病時(shí)，一定要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取敏感藥物，輪換或穿梭用藥，防治超級(jí)耐藥菌產(chǎn)生，提升豬場(chǎng)疫病防控效果，同時(shí)改善豬場(chǎng)環(huán)境，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好常規(guī)疫苗接種工作，減少腹瀉疾病發(fā)生概率，提升豬場(chǎng)養(yǎng)殖效益。

導(dǎo)致腹瀉的大腸桿菌血清型眾多，各血清型間交叉保護(hù)性差。不同地區(qū)所流行大腸桿菌血清型不同，即使在同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的大腸桿菌血清型也不同[6]，因此，研究當(dāng)?shù)鼗蚰硤?chǎng)大腸桿菌流行血清型和耐藥性，對(duì)大腸桿菌病的防控具有重要意義。可以篩選分離本地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型菌株制備自家苗。本研究對(duì)某規(guī)?；i場(chǎng)病死豬解剖，分離鑒定了致腹瀉O149的大腸桿菌血清型，為自家滅活疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。