一株致仔豬腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

大腸桿菌是自然界中一種常見的革蘭氏陰性菌，也是豬只腸道常在菌[1]，血清型眾多，致病性大腸桿菌能夠產生毒素及黏附因子，可引起豬多種疾病[2]。由產腸毒素性大腸桿菌引起的黃痢、白痢是一種仔豬常見腹瀉性疾病[3]，臨床表現為仔豬水樣腹瀉、消瘦、嚴重脫水等，發病急，死亡率高。大腸桿菌性腹瀉在養豬場普遍存在，豬場一旦有發生就很難根除，發病豬即使有耐過，也會嚴重影響生長，飼料轉化率降低，給養豬業造成嚴重經濟損失[4]。由于抗生素在豬場的濫用，大腸桿菌耐藥性顯著增加[5]，常規藥物治療效果不理想，反而加重豬只各器官組織負擔，加速死亡進程，因此，對臨床分離菌進行藥敏試驗，篩選出最佳藥物，以便采取針對性治療措施，提升防控效果。

2020年9月山東濱州某規模化豬場，7日齡內仔豬發生腹瀉，同窩仔豬發病率約為60%，病死率高達80%。同窩仔豬中先有個別仔豬發病，表現厭食、腹瀉，后其他仔豬相繼發生腹瀉，排出黃色水樣糞便，乳豬迅速消瘦、脫水、昏迷死亡。剖檢可見胃內乳汁凝固不全，乳糜管內有脂肪。腸黏膜充血，腸壁水腫，腸內充盈液體和氣體。經用青霉素、慶大霉素、紅霉素藥治療但未見明顯好轉。臨床采集發病豬肝臟、脾臟、腸道等組織送魯北獸醫診斷中心進行確診。最終分離和鑒定了一株致病性大腸桿菌，并進行了藥敏試驗，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與試驗動物

麥康凱瓊脂購自青島海博生物；革蘭氏染色液草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液等由山東綠都生物質量監察部提供；DL 2 000 Marker、rTaq購自寶生物工程（大連）有限公司。藥敏紙片、糖發酵管及生化試驗用各種試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、輪狀病毒三重熒光PCR檢測試劑盒和豬德爾塔冠狀病毒熒光PCR檢測試劑盒均由山東綠都生物科技有限公司動物疫病檢測事業部研制。致泄型大腸桿菌菌體抗原（O）診斷血清購自天津生物芯片生物技術有限責任公司。Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。18～25 g清潔級昆明系小鼠10只，購自山東省實驗動物中心。

1.2 引物

根據Gen Bank中登錄的大腸桿菌16SrRNA基因序列，設計引物，上游引物：5′-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，下游引物：5′-CGTCATCCCCACCTTCCTC-3′，目的基因序列為1 091 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 腹瀉性病毒RT-PCR檢測

按照Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒說明書操作提取樣品中病原核酸，采用豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、輪狀病毒三重熒光PCR檢測試劑盒和豬德爾塔冠狀病毒熒光PCR檢測試劑盒檢測豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒和豬德爾塔冠狀病毒。

1.4 細菌染色鏡檢與分離培養

用采集的發病豬肝臟、脾臟等病料樣本觸片、干燥固定，革蘭氏染色、顯微鏡下觀察。病料無菌條件下劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養24 h，挑取紅色中等大小光滑菌落接種于普通肉湯培養基中，置200 r/min搖床中37 ℃振搖培養18 h，取培養液0.1 mL涂布于麥康凱瓊脂培養平板，染色、鏡檢。

1.5 生化試驗

將分離菌純培養液，接種于葡萄糖、乳糖等糖發酵管及其他生化管中進行生化試驗，恒溫箱中37 ℃培養24 h后觀察結果。

1.6 PCR鑒定

取分離菌純培養液200 μL，95 ℃恒溫金屬浴10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液做模板，進行PCR擴增反應。反應體系20 μL：PCR反應預混液rTaq 10 μL，上、下游引物各1 μL（15 pmol/L），模板1 μL，加純化水補至20 μL。擴增反應程序：95 ℃3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個循環。取PCR產物3 μL于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 藥敏試驗

取滅菌棉簽，無菌操作蘸取分離菌純培養液，均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，置37 ℃培養箱數分鐘直至瓊脂表面無明顯液體時貼藥敏紙片。用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕緊貼于瓊脂上，使得紙片按照梅花狀分布，紙片間距離適當，置37 ℃培養16 h后觀察結果，測量抑菌圈直徑大小并記錄數據。

1.8 抗原血清型鑒定

取分離菌純培養液121 ℃下高壓2 h，作為待檢抗原。分別吸取待檢抗原和大腸桿菌O抗血清各10 μL，在玻片上混合均勻，同時以生理鹽水作陰性對照，觀察并記錄反應結果，2 min內出現明顯凝集者判為陽性，否則為陰性。

1.9 動物致病性試驗

取健康昆明系小鼠10只，隨機分為兩組，試驗組和對照組各5只，取分離菌純培養液腹腔注射試驗組小鼠，0.2 mL/只，對照組注射生理鹽水，同樣0.2 mL/只，觀察小鼠發病情況。

2 結果

2.1 腹瀉性病毒RT-PCR檢測

檢測結果顯示，病料中豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎、輪狀病毒和豬德爾塔冠狀病毒核酸均為陰性。

2.2 細菌分離培養結果

組織觸片染色鏡檢可見兩端鈍圓紅色桿狀細菌。麥康凱瓊脂平板劃線分離培養后，可見光滑、濕潤、紅色小菌落，直徑2～3 mm。挑取單菌落，經涂片、革蘭氏染色，干燥，鏡檢可見形態均一，兩端鈍圓、革蘭氏陰性、中等大小的桿狀細菌。

2.3 生化試驗結果

該大腸桿菌分離株能發酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖、鼠李糖、山梨醇，不能發酵衛矛醇、赤鮮醇、肌醇、菊糖，MR試驗、吲哚、靛基質試驗陽性，VP試驗、硫化氫、構椽酸鹽、尿素酶試驗陰性，符合大腸桿菌的生化特征（表1）。

表1 分離菌的生化試驗結果

2.4 PCR鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，PCR擴增產物大小為1 091 bp，符合預期結果。PCR產物測序結果顯示與大腸桿菌16S rRNA基因的同源性為100%。

2.5 藥物敏感性試驗結果

藥敏試驗結果顯示（表2），分離菌對頭孢噻呋、恩諾沙星、復方新諾明、阿莫西林高度敏感，對青霉素G、氟苯尼考、四環素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星等表現不同程度耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果 mm

2.6 血清型鑒定結果

血清分型試驗結果顯示，所分離大腸桿菌O抗原血清型為O149。

2.7 動物致病性試驗

昆明小鼠腹腔接種純培養分離菌液5 h后開始出現精神委靡、食欲不振，同時伴有站立不穩、共濟失調等神經癥狀，最終死亡，48 h內小鼠全部死亡。剖檢可見肝、脾腫大和肺出血，腸管腫脹、出血，腸內充滿黃色液體。無菌采集肝臟接種麥康凱瓊脂平板，過夜培養后，挑單菌落，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性小桿菌。對照組小鼠健活，剖殺后無菌采集肝臟進行細菌分離，結果未分離到細菌。

3 討論

豬腹瀉性疾病是危害養豬業發展的最重要的一類疾病，引起豬腹瀉原因包括細菌性、病毒性、寄生蟲性，以及環境、營養因素等。豬發生腹瀉后一定要查找原因，盡快確診，從而采取相應措施，不能憑主觀判斷隨意治療，延誤病情，可能會造成大損失。隨著全面禁抗時代的來臨，豬場細菌病發生有抬頭趨勢，豬場一定要重視細菌病防控，本案例豬場發生腹瀉初次抗生素治療不見效果后，懷疑為病毒感染所導致腹瀉，錯過疾病治療時機，豬場造成一定損失。后經實驗室診斷排除了一些常見的病毒性疾?。ㄘi流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒病和德爾塔冠狀病毒病），進一步細菌分離鑒定后確診大腸桿菌為引起豬腹瀉的病原。因此，豬場遇到類似問題時，應及早送相關實驗室進行診斷排查，確定病因后才針對性的采取治療措施。

大腸桿菌的抗原成分復雜，可分為O抗原、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中根據O抗原對大腸桿菌進行血清型分型，至今已發現170多種血清型。本試驗結果顯示，所感染大腸桿菌血清型為O149，與國內相關文獻報道的不同地區分離的豬源性大腸桿菌的血清型有一定的差異性。要選取未經抗生素治療的豬只，無菌采集相應組織器官，進行細菌分離，病料保證新鮮，低溫保存運輸。藥敏試驗結果表明，本病例所分離大腸桿菌對豬場常用抗生素青霉素G、氟苯尼考、四環素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星表現出不同程度耐藥，分析原因可能為豬場長期不規范、不科學的抗生素使用促使細菌在藥物壓力下產生耐藥質粒所致，或所感染菌本身為耐藥菌，今后豬場在防控豬病時，一定要進行藥敏試驗，選取敏感藥物，輪換或穿梭用藥，防治超級耐藥菌產生，提升豬場疫病防控效果，同時改善豬場環境，加強飼養管理，做好常規疫苗接種工作，減少腹瀉疾病發生概率，提升豬場養殖效益。

導致腹瀉的大腸桿菌血清型眾多，各血清型間交叉保護性差。不同地區所流行大腸桿菌血清型不同，即使在同一地區不同養殖場的大腸桿菌血清型也不同[6]，因此，研究當地或某場大腸桿菌流行血清型和耐藥性，對大腸桿菌病的防控具有重要意義?？梢院Y選分離本地區優勢血清型菌株制備自家苗。本研究對某規?；i場病死豬解剖，分離鑒定了致腹瀉O149的大腸桿菌血清型，為自家滅活疫苗研制奠定了基礎。