MiR-4258靶向調控CDH19對膀胱癌T24細胞分化和侵襲能力的影響

曹羅元，楊 菁，富顯果，董文婿，林應華，黃寶英

(寧德師范學院附屬寧德市醫院中心實驗室，福建寧德 352100)

MiRNAs與靶mRNA的3′UTR(untranslated region)區的堿基互補配對而起作用，使其降解或抑制其表達，從而導致特定基因的沉默，對機體生長、發育及各種疾病尤其是腫瘤的發生和發展具有重要的調節功能[1-3]。

膀胱癌是發生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統最常見的惡性腫瘤；發病率在我國泌尿生殖系腫瘤中位列第1，約30%患者確診時已發生遠處轉移[4]。特別是高度惡性或侵犯肌層的膀胱癌采用化學療法也容易復發和轉移[5-6]，尚未發現有效的治療策略。采用特異的生物學標記分子進行早期診斷和病情評估是防治膀胱癌的關鍵，而全基因組分析法為膀胱癌發現新的生物學標記分子提供了思路，其中miRNAs因其成為標記分子的潛力最大，而受到極大的關注。既往研究表明，miR-143、miR-222和miR-452可作為膀胱癌腫瘤細胞分級和非侵襲性診斷的生物學標記分子[7]；miR-325可作為膀胱癌的抑制分子[8]；miR-99a可通過調控成纖維細胞生長因子受體-3的活性，以抑制膀胱癌細胞增殖、侵襲和轉移[9]；miR-99a可作為一個有價值的診斷性生物標志分子[10]；miR-96作為膀胱癌患者的治療靶點[11]，以上研究表明miRNA在膀胱癌進程中發揮著重要作用，使miRNAs作為腫瘤標記分子成為可能。

PASCUT等[12]研究發現miR-4258在脂肪變性過程中存在關聯性，本課題組在腎小管上皮細胞轉分化過程中發現下調miR-4258可抑制轉分化過程[13]。既往研究表明細胞分化過程與腫瘤侵襲和遷移密切相關[14-16]，但關于miR-4258在膀胱癌侵襲轉移過程中的調控機制尚未見文獻報道，我們對此進行研究，尋找防護和治療膀胱癌提供新的潛在靶點。本研究發現miR-4258在CDH19 3′UTR存在調控結合位點；miR-4258可能通過下調CDH19的表達水平，進而促進了T24細胞分化，增強了膀胱癌T24細胞的遷移和侵襲能力。現將研究結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料人膀胱移行細胞癌細胞系T24購自中國科學院上海細胞庫。11例癌組織及癌旁正常組織取自寧德師范學院附屬寧德市醫院膀胱尿路上皮癌患者手術切除標本，男性7例，女性4例，患者年齡為(57.42±12.67)歲；經我院倫理委員會批準，術前告知標本用途，并簽訂了知情同意書。實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，Rt-qPCR)試劑盒購自TaKaRa公司；培養基RPMI-1640、胰蛋白酶(Trypsin)、胎牛血清購自Gibco公司，脂質體2000購自Thermo公司，pmirGLO載體購自美國Promega公司。miRNeasy mini試劑盒均購自Qiagen公司。CDH19、E-cadherin和α-SMA抗體均購自Abcam公司，所用內參和二抗購自Santa cruz公司。使用來自上海吉瑪制藥技術有限公司miR-4258 mimics、miR-4258 inhibitor、陰性對照(miRNA-ctrl)和實時定量PCR引物。

1.2 細胞分組和轉染T24細胞分miR-ctrl對照組、miR-4258 mimics組和miR-4258 inhibitor組，每組細胞按1.5×105個/孔密度接種于6孔板中。培養24 h后按照Invitrogen說明書將待轉染的miRNA oligomer 與脂質體2000 均勻混合后，室溫靜置20 min 后滴入各組細胞孔板，6 h后換完全培養基液。所有分組細胞均在37 ℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養。

1.3 靶基因預測和熒光素酶驗證實驗TargetScan 7.2和miRwalk 2預測miR-4258的靶基因，通過熒光素酶報告實驗進行靶基因驗證。CDH19上游引物5′AGCTTTGTTTAAACCG AACCCAATGGTAGTCTTA3′，下游引物5′CCGCTCGAGTAGAATGAATCATGGCATCT3′；CDH19突變上游引物5′AGCTTTGTTTAAACCCTGGCTCTATGGCTTTGAAAGCCCTA3′，下游引物5′CCGCTCGAGTAGAATGAATCATGGCATCT3′；構建野生型質粒pmirGLO-3′UTR-CDH19-WT和pmirGLO-3′UTR-CDH19-MUT突變型質粒。使用0.5 μg pmirGLO，pmirGLO-3′UTR-CDH19-WT和pmirGLO-3′UTR-CDH19-MUT分別與25 nm的miR-4258 mimics或25 nm的miR-NC共轉染T24細胞。

1.4 定量PCR檢測miR-4258差異表達用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，分光光度計定量檢測RNA樣品，將A260 nm/A280 nm比值為1.8～2.1的RNA樣品逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板定量樣本中miR-4258和U6snRNA的表達量。miR-4258上游引物5′GCATCCCCGCCACCG3′，下游引物5′TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC3′；U6snRNA上游引物5′ATTGGAACGATACAG AGAAGATT3′，下游引物5′GGAACGCTTCACGAATTTG3′。采用TaKaRa SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit，經ABI StepOnePlus Real-Time PCR System擴增。以U6snRNA為內參，根據2-△△Ct各組基因的相對含量，實驗獨立重復3次，3次結果取平均值。

1.5 免疫印跡(Western blot)檢測CDH19、E-cadherin和α-SMA的表達T24細胞按分組干預培養72 h，提取各組總蛋白，經BCA定量后，取細胞裂解蛋白10 μg，經10 g/L SDS-PAGE 凝膠電泳2 h，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)轉膜(200 mA，1 h)； 50 g/L脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，分別加入E-cadherin、α-SMA、CDH19和磷酸甘油醛脫氫酶抗體，4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h；洗膜后加電化學發光劑(electrochemiluminescence，ECL)顯影，將PVDF 膜放入Bio-Rad 化學發光成像系統中成像，每組實驗獨立重復3次，3次結果取平均值。所得免疫印跡通過Image J軟件獲得各實驗組與內參灰度值的比值。

1.6 細胞遷移實驗(Transwell)小室細胞侵襲能力檢測各組細胞接種前進行饑餓培養12 h，將Transwell小室(已鋪Matrigel膠)室溫水化后將膀胱癌細胞T24細胞基礎培養基200 μL/室接種于Transwell小室上室，細胞終濃度為1×104個/室；向下室加入600 μL含體積分數為20%的胎牛血清的培養基。37 ℃、體積分數為5%的CO2培養24 h，后取出Transwell小室，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞1 g/L結晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，計數各個小室細胞數。

1.7 明膠酶譜法測定MMP-2活性各組細胞培養48 h，收集各組同體積培養液濃縮后，在10%的聚丙烯酰胺凝膠(含0.1 %明膠)電泳分離蛋白，體積分數為2.5%的TritonX-100洗30 min 2次，后將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育48 h。經染色液染色，甲醇脫色后，顯示出透亮帶，采用Image J分析。

2 結 果

2.1 miR-4258靶基因預測和驗證在線生物信息預測數據庫預測miR-4258的靶基因，提示miR-4258潛在的作用靶基因是CHD19(圖1A)。CDH19是位于18號染色體上，編碼一種鈣依賴細胞-細胞黏附糖蛋白，是Ⅱ型鈣黏蛋白基因，鈣黏蛋白的丟失可能與癌癥的形成有關。

我們通過熒光素酶報告實驗進行靶基因驗證，發現當重組質粒和miR-4258 mimics共轉染T24細胞時，CDH19-3′UTR-WT野生型組的熒光素酶活性較對照組顯著下降(圖1B)，而突變型組熒光素酶活性無明顯變化。說明CDH19是miR-4258的直接靶點，miR-4258通過直接與CDH19的3′UTR上的序列結合，抑制CDH19的轉錄，負調控CDH19蛋白的表達；且RT-qPCR結果顯示，miR-4258在膀胱癌及癌旁正常組織中的相對表達量分別為(6.63±1.49)和(2.79±0.68)，兩組比較差異有統計學意義(t=3.711，P<0.01，圖1D)。

2.2 miR-4258對T24細胞分化的作用Western blot檢測 miR-4258 mimics和inhibitor對膀胱癌細胞T24上皮間充質轉化標志蛋白的作用，發現與miR-ctrl組相比miR-4258 mimics組中的E-cadherin和CDH19蛋白表達量顯著降低，而α-SMA的表達明顯下調(圖2)。E-cadherin在上皮細胞間質轉化過程中發揮著重要的作用，對維持上皮細胞黏性和極性具有重要的作用。α-SMA作為間質細胞特征分子，是判斷間質細胞的重要標志蛋白。既往研究表明上皮-間充質轉化過程與上皮細胞的腫瘤密切相關[14-16]。本研究發現miR-4258的差異表達和T24細胞上皮-間充質轉化過程密切相關，可能通過調控上皮-間充質轉化過程，進而發揮在腫瘤侵襲轉移過程中的調控作用。

A:Western blot檢測E-cadherin的蛋白表達水平；B:Western blot檢測CDH19和α-SMA的蛋白表達水平；C：E-cadherin、CDH19和α-SMA的蛋白相對表達水平。與miR-ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 miR-4258對膀胱癌T24細胞侵襲能力的影響膀胱癌T24細胞是高度轉移性的細胞，為了探究miR-4258是否影響T24細胞侵襲能力，本研究通過Transwell侵襲實驗發現，與miR-ctrl組相比，miR-4258 mimics 組侵襲細胞數目顯著增加[(82±6.81)vs.(60±5.57)，P<0.01]；miR-4258 inhibitor組侵襲細胞數目顯著減少[(42±4.58)vs.(60±5.57)，P<0.01]，而miR-ctrl組和正常處理組差異無統計學意義(圖3)。

A：Transwell實驗測定各組細胞遷移能力(結晶紫，×100)；B:實驗各組細胞遷移數量。與miR-ctrl組比較，*P<0.05,** P<0.01。

2.4 miR-4258對基質金屬蛋白酶2酶活性的影響基質金屬蛋白酶幾乎能夠降解細胞外基質的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起到了關鍵作用。基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)基因是基質金屬蛋白酶家族的重要成員，屬于明膠酶，涉及腫瘤細胞生長、凋亡、遷移、侵襲和轉移，是最重要的抗腫瘤靶標。明膠酶譜法是一種簡單而有效的檢測蛋白水解酶的方法。本研究采用明膠酶譜法測定miR-4258對T24細胞MMP2酶活性的影響，結果顯示，miR-4258 mimics組MMP2酶活性較miR-ctrl組顯著提高，而miR-4258 inhibitor組MMP2酶活性較miR-ctrl組明顯降低，說明miR-4258表達水平影響了MMP2活性(圖4)。

A：明膠酶譜法測定各組細胞MMP2酶活性；B:MMP2相對酶活性；與miR-ctrl組比較，

3 討 論

近年來研究發現miRNAs在腫瘤發生發展過程中起著重要作用，miRNAs可能成為腫瘤診斷和治療的新靶點[17-19]，如尿液中miR-96與miR-183可作為膀胱上皮癌的腫瘤標記物[20]。BRAICU等[21]研究表明miRNAs將作為膀胱癌預后的關鍵分子，該團隊在膀胱癌中發現的miRNA-mRNA調控網絡作為生物標志物或靶向治療策略的開發時機或已成熟。因此，腫瘤細胞特異miRNA的差異表達將為腫瘤早期診斷帶來巨大的便利與突破[22-24]。腫瘤細胞侵襲轉移是惡性腫瘤的主要特征，伴隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞的黏性不斷下降，而侵襲轉移能力不斷增強[25]。以上研究說明，miRNAs在膀胱癌侵襲和轉移過程中發揮著重要的作用，可作為膀胱癌潛在生物標志物和治療的靶點，具有重要的臨床指導意義。本課題組選取當前癌癥治療方案-基因靶向治療中的miRNA進行研究，我們通過RT-qPCR檢測膀胱上皮癌組織及癌旁正常組織的miR-4258表達情況。結果表明，miR-4258在膀胱上皮癌組織中的表達水平明顯高于其癌旁組織，差異有統計學意義(t=3.711，P<0.01)。為進一步研究miR-4258在膀胱癌中的具體作用及調控機制，我們通過生物信息學軟件預測miR-4258的靶基因并采用熒光素酶報告基因實驗進行驗證；結果顯示，CDH19是miR-4258的靶基因。隨后，我們采用細胞實驗進一步探究了miR-4258對細胞分化和侵襲的影響，運用脂質體轉染技術將miR-4258 mimics、inhibitor和miR-ctrl分別轉染至膀胱癌T24細胞中，檢測mRNA和蛋白的表達水平。結果表明與miR-ctrl相比，miR-4258 mimics組CDH19和E-cadherin的蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，而α-SMA的表達水平顯著提高(P<0.01)；說明miR-4258的過表達促進了T24細胞的轉分化過程，而既往研究表明細胞分化過程與腫瘤侵襲和遷移密切相關[14-16]。通過侵襲實驗和檢測MMP2酶活性探討miR-4258對膀胱癌生物學功能的影響，結果發現，miR-4258 mimics組MMP2的活性較miR-ctrl組顯著提高(P<0.01)，同時T24細胞的侵襲能力也得到明顯增強。

CDH19是鈣依賴性細胞黏附糖蛋白，鈣黏蛋白的丟失可能與癌癥的形成有關，CDH19在惡性膠質瘤進程中具有重要的作用[26]。我們發現在T24細胞中，miR-4258通過靶向負調控CDH19的表達水平，miR-4258的差異表達能夠顯著影響CDH19 mRNA及蛋白質的表達，來調控T24細胞的分化、侵襲。同時miR-4258 mimics也增強了T24細胞的遷移能力，并提高了MMP2的酶活性。MMP2是降解上皮細胞向間質細胞轉分化過程中所生成的細胞外基質的主要分子，它通過血管和淋巴系統在膀胱癌的腫瘤侵襲和末端轉移過程中發揮著重要作用。

綜上所述，miR-4258在膀胱上皮癌組織中顯著高表達，上調miR-4258表達促進了T24細胞的分化和侵襲能力，其調控方式可能是miR-4258靶向調控CDH19的表達，進而發揮在膀胱癌T24細胞分化和侵襲過程中的調控作用；提示miR-4258在膀胱癌細胞生物學功能中發揮重要作用。后續我們將在組織學上進一步驗證CDH19的差異表達，比較膀胱癌組織和癌旁組織間CDH19的表達水平，以及miR-4258的動物實驗研究，繼續探究miR-4258作為膀胱癌生物學分子標記的可能性，為臨床實踐中膀胱癌的診療提供科學依據與實踐基礎。