7,8-DHF對大鼠心肌缺血-再灌注損傷影響及機制

[摘要]目的 探討7，8-二羥基黃酮（7，8-DHF）對大鼠心肌缺血-再灌注（I/R）損傷的影響及機制。方法 選取雄性健康Wistar大鼠18只，隨機分為3組，每組6只。假手術組（Sham組）大鼠開胸，左冠狀動脈前降支（LAD）只穿線不結扎;I/R組先結扎LAD缺血30 min，再恢復血供3 h;I/R+7，8-DHF組先缺血30 min，恢復血供前10 min腹腔注射7，8-DHF（10 mg/kg）。心臟恢復血供3 h后處死大鼠，對血清中乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的活力進行檢測，取結扎線下方的心肌組織采用Western blot方法檢測與凋亡有關的蛋白。結果與Sham組相比較，I/R組大鼠血清中LDH和CK-MB的活力分別升高35%和71%，7，8-DHF預處理則部分抑制了上述變化（F=18.770、5.422，q=3.788～7.800，P<0.05）。Western blot檢測顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達顯著降低，而Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著增加;與I/R組相比，I/R+7，8-DHF組Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著減少（F=6.217～14.720，q=3.797～7.546，P<0.05）。結論 7，8-DHF預處理對大鼠的心肌I/R損傷具有保護作用，該作用可能與其抑制心肌細胞凋亡有關。

[關鍵詞]黃酮類;心肌再灌注損傷;細胞凋亡;大鼠

[中圖分類號]R337.1;R542.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0210-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of 7，8-dihydroxyflavone （7，8-DHF） on myocardial ischemia-reperfusion （I/R） injury in rats and its mechanism. "Methods A total of 18 healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into sham-operation group （sham group）， I/R group， and I/R+7，8-DHF group， with 6 rats in each group. The rats in the sham-operation group were given thoracotomy without ligation of the left anterior descending coronary artery （LAD）， those in the I/R group were given ligation of the LAD for 30 min of ischemia， followed by the restoration of blood supply for 3 h， and those in the I/R+7，8-DHF group were given ischemia for 30 min， followed by intraperitoneal injection of 7，8-DHF （10 mg/kg） at 10 min before the restoration of blood supply. The rats were sacrificed at 3 h after the restoration of blood supply， and the serum levels of lactate dehydrogenase （LDH） and creatine kinase-MB （CK-MB） were measured. The myocardial tissue below the ligature was collected to measure apoptosis-related proteins by Western blot."Results Compared with the sham group， the I/R group had significant increases in the serum levels of LDH and CK-MB （increased by 35% and 71%， respectively）， and these changes were partially inhibited by 7，8-DHF pretreatment （F=18.770 and 5.422，q=3.788-7.800，Plt;0.05）. Western blot showed that compared with the sham group， the I/R group had a significant reduction in the protein expression of Bcl-2 and significant increases in the protein expression of Bax and cleaved caspase-3 in myocardial tissue; compared with the I/R group， the I/R+7，8-DHF group had a significant increase in the protein expression of Bcl-2 and significant reductions in the protein expression of Bax and cleaved caspase-3 （F=6.217-14.720，q=3.797-7.546，Plt;0.05）.Conclusion Pretreatment with 7，8-DHF has a protective effect against myocardial I/R injury in rats， possibly by inhibiting cardiomyocyte apoptosis.

[KEY WORDS]flavones; myocardial reperfusion injury; apoptosis; rats

心肌缺血通常由冠狀動脈的狹窄或阻塞所引發。心肌組織中血流的減少或者阻斷會引起冠狀動脈所支配區域的營養物質供給和氧氣供應減少，最終使心肌細胞發生凋亡或壞死[1-2]。但是缺血部位心肌組織的血供恢復后，由于細胞內活性氧增多、鈣離子失衡、細胞能量代謝異常、炎癥反應等原因[3]，會使得心肌細胞遭受更為嚴重的損傷[4]，即缺血-再灌注（I/R）損傷。I/R損傷通常會引發心肌頓抑、室內壓下降等心肌功能的抑制，其預防與治療長期以來都是心血管研究領域的重要課題。7，8-二羥基黃酮（7，8-DHF）是黃酮化合物之一。最近有研究表明，7，8-DHF是酪氨酸激酶B（TrkB）受體的特異性激動劑[5]，具有強大的神經營養和保護作用[6]。在心血管疾病的相關研究中發現，苯腎上腺素誘導的大鼠胸主動脈收縮可被7，8-DHF顯著抑制， 而且該作用與降低細胞內鈣水平和激活一氧化氮/環鳥苷酸信號通路有關[7]。此外，7，8-DHF還能拮抗過氧化氫（H2O2）誘導的細胞凋亡[8]。但是7，8-DHF對I/R損傷是否具有保護作用尚未見報道。本研究通過對大鼠左冠狀動脈前降支（LAD）進行結扎處理，建立心肌I/R損傷的動物模型，探討恢復血供前7，8-DHF預處理對再灌注心肌是否具有保護作用，并初步探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品和儀器

7，8-DHF（D1916）購自東京化成工業株式會社。抗Bcl-2抗體（AB112）、抗Bax抗體（AF0057）和BCA蛋白檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司，抗cleaved caspase-3（CST-9661）抗體購自美國CST公司，抗β-actin抗體購于北京博奧森生物技術公司，實驗所用其他試劑均為國產分析純。所用實驗儀器包括小動物呼吸機（型號ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司）、Eppendorf高速離心機、SpectraMax M5多功能酶標儀、微量分析天平和Western 顯影儀等。

1.2 動物分組及處理

實驗選用8～10周齡的雄性Wistar大鼠18只，體質量（250±10）g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（許可證號：SCXK（魯）20190003）。實驗開始前，大鼠先在23～25 ℃、12 h/12 h明暗周期環境下飼養7 d，自由飲水和進食。造模前，大鼠先禁食12 h，期間自由飲水。將大鼠隨機分為3組，每組6只。①假手術組（Sham組，A組）：大鼠麻醉并且固定后，通過口腔接入呼吸機輔助其呼吸;打開胸腔，將縫合線穿過LAD下方但不結扎，20 min后腹腔注射含體積分數0.05二甲基亞砜（DMSO）的磷酸鹽緩沖液（PBS），10 min后縫合傷口。②I/R組（B組）：開胸，結扎LAD 20 min后腹腔注射含體積分數0.05 DMSO的PBS，10 min后取出結扎線，即缺血30 min后恢復血供。③I/R+7，8-DHF組（C組）：在結扎LAD 20 min后腹腔注射7，8-DHF（10 mg/kg），其他處理與I/R組相同。所有大鼠均在恢復血供3 h后處死。本實驗過程遵循國際實驗動物使用標準和倫理學要求。

1.3 血清及心肌標本制備

大鼠心臟恢復血供3 h后，通過尾靜脈取血約1.0 mL，先存放于4 ℃冰箱中靜置1 h，隨后再以3 000 r/min離心15 min，分離血清于新EP管中，凍存于-80 ℃冰箱備用。將心臟快速取出，放入預冷的PBS中清洗，保留結扎線以下的部分，剪去右心室，其余部分（左心室為主）用液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.4 血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）活力檢測

血清標本送至海軍青島第一療養院檢驗科測定。血清中LDH的活力采用速率法測定，CK-MB的活力采用免疫抑制法測定。

1.5 心肌細胞凋亡有關蛋白的Western blot檢測

取20～30 mg心肌組織，將其充分剪碎后放入預冷的玻璃勻漿器中，加入200～300 μL蛋白裂解液充分研磨，以12 000 r/min離心20 min，留取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。每個樣本的蛋白上樣量均為20 μg，蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜上，用100 g/L脫脂奶粉室溫慢搖封閉90 min，分別加入抗Bcl-2抗體（1∶1 000）、抗Bax抗體（1∶1 000）、抗cleaved caspase-3抗體（1∶1 000）和抗β-actin抗體（1∶10 000）。在4 ℃冰箱內的搖床上慢速搖動孵育過夜，隨后以TBST洗膜3次，每次10 min，再加入二抗，室溫孵育1 h后，以TBST洗膜3次，最后用ECL發光液顯影。用軟件Image J對條帶的灰度值進行分析。結果以目的蛋白灰度值與相對應的β-actin灰度值的比值表示。

1.6 統計學分析

應用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行統計學分析。結果以x2±s的形式表示，多組數據比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey法。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 7，8-DHF對血清LDH和CK-MB活力的影響

與Sham組相比，I/R組大鼠血清中LDH的活力升高了35%（F=18.770，q=7.167，P<0.01）;與I/R組相比，I/R+7，8-DHF組LDH活力下降了28%（q=7.800，P<0.01）。血清CK-MB活力的變化與LDH類似，與Sham組相比較，I/R組大鼠血清中CK-MB的含量升高了71%（F=5.422，q=4.240，P<0.05）。與I/R組大鼠相比，I/R+7，8-DHF組CK-MB活力下降了37%（q=3.788，P<0.05）。提示7，8-DHF抑制了I/R誘導的心肌細胞損傷。見表1。

2.2 7，8-DHF對心肌細胞凋亡有關蛋白表達影響

與Sham組相比，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白的表達顯著降低（F=6.217，q=4.698，P<0.05），Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著增加（F=14.720、7.653，q=7.546、4.975，P<0.01），表明I/R損傷會導致心肌細胞發生凋亡。與I/R組相比，I/R+7，8-DHF組Bcl-2蛋白表達升高了86%（q=3.797，P<0.05），Bax蛋白表達減少了45%（q=4.977，P<0.01），cleaved caspase-3蛋白表達減少了42%（q=4.584，P<0.05），說明7，8-DHF有效抑制了I/R損傷造成的心肌細胞凋亡。見表2和圖1。

3 討 論

急性心肌梗死（AMI）通常由冠狀動脈內血流急劇減少或中斷造成，會導致心肌組織中血液供應的減少，從而引發嚴重后果。近年來AMI的防治已取得較大進展[9]，但是缺血后的心肌組織在血流恢復之后，依然會出現生理功能的進一步損傷，稱為心肌I/R損傷。I/R損傷會導致心肌頓抑、心律失常和心肌壞死等惡性后果，其預防與治療一直是AMI治療中的重要環節，但是目前還無特別有效的防治方法。

心肌I/R損傷存在明顯的心肌細胞凋亡，這可能與氧化應激損傷、細胞內鈣超載、炎癥反應等密切相關[10-11]。細胞凋亡受到多種信號通路和蛋白的調控。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族蛋白成員，Bax蛋白形成二聚體后可增加線粒體膜通透性，促進線粒體內細胞色素C釋放，誘導細胞凋亡，而Bcl-2蛋白則通過抑制Bax二聚體形成抑制細胞凋亡。細胞凋亡中最重要的效應酶是caspase-3，它激活后可以裂解形成分子量為17 000～19 000的片段，稱為cleaved caspase-3。所以通過檢測Bcl-2、Bax以及cleaved caspase-3蛋白水平，可以評估心肌細胞凋亡的發生[12]。

7，8-DHF是黃酮家族中的一員，具有神經保護[13]、抗氧化[14]、抗炎癥[15]、抗腫瘤[16]、抗增殖[17]等多種生物學作用。黃酮類化合物的心血管保護作用已有較多研究[18]。例如，黃芩苷可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號途徑以及抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）信號傳導來抑制心肌細胞凋亡和炎癥[19]，從而抑制心肌I/R損傷。但是，7，8-DHF對I/R造成的心肌組織損傷是否具有保護作用尚無相關研究。

心肌細胞受到損傷時，細胞膜通透性增強，細胞內的某些酶釋放入血，血清中這些酶活力的升高程度則反映出了心肌壞死的程度[20]。本研究首先通過測定血清中LDH和CK-MB的變化，觀察7，8-DHF預處理對缺血心肌損傷的保護作用。結果顯示，I/R組大鼠血清中LDH和CK-MB的活力均明顯升高，7，8-DHF預處理則部分抑制了上述變化，提示7，8-DHF預處理對再灌注的心肌組織具有一定的保護作用。為了進一步探討7，8-DHF保護作用的機制，本研究通過檢測Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達來評估心肌細胞凋亡的發生[21]。結果顯示，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達降低，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達升高，提示I/R大鼠心肌存在明顯的細胞凋亡，7，8-DHF預處理可顯著逆轉上述變化，進一步驗證了7，8-DHF的心肌保護作用，并且表明該作用與其抑制心肌細胞凋亡有關。本研究結果為7，8-DHF應用于心肌I/R損傷的防治提供了一定的實驗依據。

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（本文編輯 馬偉平）