木犀草素聯合下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞生物學特性的影響

王學博 符攀峰 任紅娟 孫 麗 白峰巖

宮頸癌具有惡性程度高、發展速度快等特點，手術切除、放化療等是目前治療宮頸癌的主要方法，但是這些治療方法的療效有一定的局限性。分子靶向治療是近些年來研究發現的具有潛在應用前景的腫瘤治療途徑，中藥聯合分子靶向治療可能是未來腫瘤治療的一種有效途徑。木犀草素是天然的黃酮類化合物，具有抑制腫瘤生長和轉移的作用。miR-425-5p是一個在腫瘤細胞中過度表達的微小RNA分子，具有促進胰腺癌、胃癌等腫瘤細胞浸潤和轉移的作用。有研究顯示，miR-425-5p在宮頸癌患者中呈高表達，且與腫瘤患者的臨床分期和轉移程度有關。本文擬探討木犀草素聯合下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，以期為尋找治療宮頸癌有效的治療方案提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細胞購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)抗體(生產廠家：Cell Signaling Technology)；木犀草素(生產廠家：成都格利普生物科技有限公司)；c-caspase-9抗體、p-Akt抗體(生產廠家：美國Santa Cruz)；c-caspase-3抗體(生產廠家：美國ABCAM)；miRNA first-strand cDNA synthesis kit (生產廠家：美國Thermo Fisher)；inhibitor control、miR-425-5p inhibitor[生產廠家：吉滿生物科技(上海)有限公司]；MMP-9抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗(生產廠家：美國cytoskeleton)；引物(生產廠家：武漢金開瑞生物工程有限公司)；Lipofectamine 2000(生產廠家：美國Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 HeLa細胞轉染及miR-425-5p表達水平檢測 HeLa細胞中轉染inhibitor control、miR-425-5p inhibitor操作同Lipofectamine 2000，步驟如下：將inhibitor control、miR-425-5p inhibitor和Lipofectamine 2000分別用DMEM稀釋，混合后添加到細胞中，培養24 h以后，更換新鮮的細胞培養液繼續培養。細胞在轉染24 h后，采用Realtime PCR測定。即在細胞中添加Trizol試劑，充分裂解后，添加氯仿溶液，4℃，3000 r/min離心15 min，吸取上層溶液，異丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗滌2次，-20℃保存。按照miRNA first-strand cDNA synthesis kit 試劑盒進行反轉錄，反轉錄步驟：吸取2 μL的RNA，加入1 μL的gDNA Eraser、2 μL的gDNA Eraser Buffer，添加RNase-free HO至10 μL，在42℃條件下孵育2 min，取出反應液，添加4 μL的5×PrimeScript Buffer、1 μL的PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μL的RT Prime Mix 4，添加RNase-free HO至20 μL，在37℃條件下反應15 min，85℃反應5 s，在4℃保存。取1 μL的cDNA，添加10 μL的SYBR Prime Ex Taq II、0.4 μL的上游和下游引物、0.4 μL的ROX Reference Dye II，添加RNase-free HO至20 μL，PCR反應條件：第一階段95℃預變性30 s；第二階段：95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40個循環。以U6作為參照，根據反應得到的Ct值(2法)分析miR-425-5p表達水平。U6 sense 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAATACTAAAAT-3’，Anti-sense 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。miR-425-5p sense 5’-GGGGAGTTAGGATTAGGTC-3’，Anti-sense 5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

1.2.2 細胞分組 將HeLa細胞分成Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p、木犀草素+Anti-NC、木犀草素+Anti-miR-425-5p共5組，Control組為不做轉染的宮頸癌HeLa細胞，Anti-NC組、Anti-miR-425-5p組分別轉染inhibitor control、miR-425-5p inhibitor的宮頸癌HeLa細胞，木犀草素+Anti-NC組、木犀草素+Anti-miR-425-5p組分別轉染inhibitor control、miR-425-5p inhibitor并且經過40 μmol/L木犀草素處理培養的宮頸癌HeLa細胞。每個實驗設置3復孔，實驗重復3次。

1.2.3 HeLa細胞增殖檢測 采用MTT法檢測HeLa細胞增殖，結果以A值表示。操作方法：將5組HeLa細胞種植到96孔板內(接種密度為每孔5 000個細胞)，把培養板放在37℃，5% CO培養箱中培養24 h以后，將培養板取出。用移液槍分別在孔內添加MTT工作液，每孔10 μL，繼續反應4 h。將培養板內的液體吸棄，添加150 μL的DMSO溶液，震蕩反應5 min。把培養板放在酶標儀上，測定每孔的A值(波長490 nm)。

1.2.4 HeLa細胞克隆能力測定 采用平板克隆實驗測定。操作方法：將5組細胞種植到6孔板中，每個孔中加400個細胞。培養12 d以后，肉眼可見形成克隆團。用磷酸緩沖鹽洗滌細胞，結晶紫染色以后，計數克隆形成數目。以克隆形成數目占接種細胞數量的百分比表示克隆形成率。

1.2.5 HeLa細胞凋亡檢測 采用流式細胞術測定。操作方法：將5組細胞分別培養24 h后，添加0.25%的胰蛋白酶消化，用磷酸緩沖鹽洗滌。最后添加結合緩沖液將細胞懸浮，再加入PI及Annexin V-FITC溶液，混合均勻以后，立即用流式細胞儀測定。

1.2.6 HeLa細胞侵襲和遷移測定 遷移實驗采用Transwell小室檢測。操作方法：用不含血清的細胞培養液將5組HeLa細胞懸浮，吸取200 μL添加到Transwell小室的上室中，吸取500 μL的含血清細胞培養液添加到下室中。放在37℃，5% CO培養箱中培養24 h以后，取出小室，以多聚甲醛固定，結晶紫染色處理以后，放在顯微鏡下觀察穿膜細胞數目(隨機選5個視野)，即為細胞遷移數目。細胞侵襲實驗檢測前添加基質膠將小室濕化，其余步驟同遷移實驗。

1.2.7 HeLa細胞中p-Akt、c-caspase-3、c-caspase-9、MMP-9、MMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測。操作方法：將5組HeLa細胞分別培養24 h，用移液器把孔內液體吸棄，分別添加蛋白裂解溶液，放在冰上將細胞完全裂解。把裂解液轉移到離心管中，以3000 r/min離心10 min，細胞蛋白存在于上清溶液中。SDS-PAGE凝膠用10%分離膠和5%的濃縮膠。蛋白在上樣之前同Loading Buffer混合煮沸變性處理。蛋白電泳上樣量為40 μg，電泳電壓為90 V，肉眼觀察到溴酚藍染料到達底部以后方可停止電泳。轉膜電壓為80 V，轉膜操作在冰上進行，轉膜時間為60 min。取出電轉后的NC膜，置于封閉液(5%牛血清白蛋白)中將非特異性位點封閉以后，然后同一抗(反應條件為4℃過夜，c-caspase-3、c-caspase-9稀釋倍數為1∶4 000，MMP-9、MMP-2、Bcl-2、Bax稀釋倍數為1∶1 000，p-Akt稀釋倍數為1∶400，Akt稀釋倍數為1∶600)、二抗稀釋液(反應條件為室溫孵育1 h，稀釋倍數為1∶2 000)孵育結合。ECL方法顯色以后，分析內參(β-actin)和目的蛋白(p-Akt、c-caspase-3、c-caspase-9、MMP-9、MMP-2、Bcl-2、Bax)灰度值，以目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

2 結果

2.1 Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 3組HeLa細胞中miR-425-5p表達水平比較 與Control組、Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組宮頸癌HeLa細胞中miR-425-5p表達水平(0.39±0.06)較Control組(1.00±0.07)、Anti-NC組(0.97±0.12)降低，差異有統計學意義(

F

=46.467，

P

=0.000)。2.2 5組HeLa細胞增殖、克隆、凋亡及蛋白表達情況比較 與Control組、Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組、木犀草素+Anti-NC組HeLa細胞A值、克隆形成率下降，細胞凋亡率升高，c-caspase-3、c-caspase-9、Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平減少，差異均有統計學意義(

P

<0.05)，且木犀草素+Anti-miR-425-5p組細胞A值、克隆形成率下降更明顯，細胞凋亡率也更高，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 5組HeLa細胞增殖、克隆、凋亡及蛋白表達情況比較

2.3 5組HeLa細胞侵襲與遷移數目和MMP-9、MMP-2蛋白表達比較 與Control組、Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組、木犀草素+Anti-NC組宮頸癌HeLa細胞侵襲與遷移數目和MMP-9、MMP-2蛋白表達水平均降低，差異有統計學意義(

P

<0.05)，且木犀草素+Anti-miR-425-5p組細胞侵襲與遷移數目和MMP-9、MMP-2蛋白表達水平下降更明顯，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表2。2.4 5組HeLa細胞Akt、p-Akt蛋白表達水平比較 與Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組、木犀草素+Anti-NC組宮頸癌HeLa細胞p-Akt蛋白表達水平均降低，差異有統計學意義(

P

<0.05)，且木犀草素+Anti-miR-425-5p組細胞p-Akt蛋白表達水平下降更明顯，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表3。

表2 5組HeLa細胞侵襲與遷移數目和MMP-9、MMP-2蛋白表達水平比較

表3 5組HeLa細胞Akt、p-Akt蛋白表達水平比較

3 討論

木犀草素廣泛存在于西蘭花、芹菜、胡椒等植物中，具有抗宮頸癌細胞增殖的作用。miR-425-5p是一個與細胞分化、增殖等有關的重要調節因子。miR-425-5p在胃癌、肺癌、結直腸癌等腫瘤組織中呈高表達，并與腫瘤患者的預后、分期、浸潤程度等有關， miR-425-5p可能是腫瘤治療的潛在靶點。研究發現，miR-425-5p在宮頸癌患者中也呈高表達。Akt信號通路影響細胞增殖、凋亡、遷移等過程，降低腫瘤細胞中Akt信號的激活程度對于腫瘤進展具有明顯的抑制作用。本實驗探討木犀草素聯合下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞生物學特性的影響及可能機制，旨在為宮頸癌治療提供思路。

本研究結果顯示，木犀草素處理后的宮頸癌HeLa細胞A值、克隆形成率、細胞侵襲與遷移數目均顯著降低(

P

<0.05)，凋亡率顯著升高(

P

<0.05)，這說明木犀草素能夠在體外降低宮頸癌HeLa細胞惡性生長能力，激活細胞凋亡，降低細胞遷移和侵襲能力。這與相關研究一致，均說明木犀草素聯合下調miR-425-5p有抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等作用。本研究還發現，與單純下調miR-425-5p或木犀草素處理組相比，木犀草素聯合下調miR-425-5p后的宮頸癌HeLa細胞A值、克隆形成率、侵襲與遷移數目均顯著降低(

P

<0.05)，表明木犀草素和下調miR-425-5p聯合之后對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用更強，對細胞凋亡誘導的作用也更強，木犀草素和下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞的抑制功效大大增加，有望成為宮頸癌治療的潛在方法。同時本研究還發現，木犀草素聯合下調miR-425-5p后的宮頸癌HeLa細胞中p-Akt蛋白表達水平顯著降低(

P

<0.05)。Akt在腫瘤中發揮類似癌基因的作用，其磷酸化后形成p-Akt參與介導caspase凋亡反應和基質降解酶MMPs的表達，從而影響細胞增殖、凋亡、遷移等過程。相關研究顯示，降低腫瘤細胞中Akt信號的激活程度對于腫瘤進展具有明顯的抑制作用。本研究結果提示木犀草素聯合下調miR-425-5p降低了宮頸癌細胞中Akt信號通路的激活水平，因此推測，木犀草素聯合下調miR-425-5p可能是通過抑制Akt信號的激活程度從而抑制MMP-2、MMP-9的表達，并促進c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表達，這可能是木犀草素聯合下調miR-425-5p抗宮頸癌細胞惡性進展的作用機制。

綜上所述，木犀草素聯合下調miR-425-5p可在體外抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，作用機制可能與抑制Akt信號通路的激活有關。