血管抑制蛋白2在乳腺癌中的表達情況及其對患者預后的影響

沈鑫鑫 金 磊 趙 倩 迪力夏提·金斯汗 朱麗萍 楊 亮

乳腺癌發病率位于女性惡性腫瘤的第1位。盡管乳腺癌在診療水平上已取得重大進展，但部分乳腺癌患者的預后仍不能令人滿意，其中浸潤性乳腺癌易出現局部復發、遠處轉移和治療抵抗。乳腺癌細胞浸潤和通過腫瘤滋養血管轉移的分子機制仍需要進一步研究。研究發現，血管抑制蛋白(vasohibin, VASH)家族中VASH-2蛋白與腫瘤的發生及血管生成相關。有研究報道，VASH-2是一種內皮細胞非固有的不依賴血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的促血管生成因子。VASH-2在肝細胞惡性腫瘤、胃惡性腫瘤、和胰腺惡性腫瘤中均有表達并且能夠促進腫瘤新生血管形成，在癌細胞遷移過程中發揮重要作用。然而，VASH-2對乳腺癌的具體作用尚不清楚。本研究運用免疫組織化學法檢測VASH-2在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達情況，并分析其表達與患者預后的關系，為進一步研究其功能和機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月1日至2013年12月31日新疆醫科大學附屬腫瘤醫院185例原發性乳腺癌病例為研究對象：患者年齡30～70歲，平均(48.60±11.21)歲；未絕經者100例，絕經者85例。收集患者年齡、絕經情況、腫瘤大小、細胞學分級、組織學類型、淋巴結轉移等情況。納入標準：①病理免疫組織化學方法確診為乳腺癌；②術前未接受新輔助治療；③卡式評分(Karnofsky performance status, KPS)≥90分，接受手術治療者；④無其他系統惡性腫瘤病史；⑤術前同意標本采集并簽署知情同意書。本研究經新疆醫科大學第三臨床醫學院倫理委員會批準。排除標準：排除遠處轉移乳腺癌及特殊類型浸潤性乳腺癌(炎性乳腺癌、肉瘤、微乳頭狀癌、粘液癌、小管癌、髓樣癌)者。

1.2 方法 術前采用B超血管成像了解病灶血流分布情況，并在其引導下對乳腺癌病灶富血供區域及乏血供區域進行穿刺(血流豐富程度的分級通常分為四級：0級為腫塊內未見血流信號顯示；1級為少量血流，腫塊內見1～2個點狀血流信號；2級為中量血流，腫塊內見3～4個點狀血流信號或一條壁管清晰的血管；3級為豐富血流，腫塊內見4個以上點狀血流或2條管壁清晰的血管。定義0～1級為乏血供區域，2～3級為富血供區域)，并取出相應區域組織；在術中取得乳腺癌及癌旁組織標本，對所有標本采用免疫組化(Immunohistochemistry)SP法染色，根據試劑說明書步驟進行染色，采用微波法進行抗原修復。

1.3 免疫組化染色結果判定 由3名病理科醫師采用盲法判讀免疫組化染色結果，染色結果判讀采用EnVison法。標本處理：10%甲醛固定標本，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用免疫組化自動染色儀染色。以已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替VASH-2一抗(美國Proteintech公司，兔抗人VASH-2多克隆抗體，稀釋比為1∶1 000)作為陰性對照，光鏡下觀察。VASH-2主要表達于細胞質中，呈棕黃色染色顆粒，根據細胞染色強度，分為未著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色；采用半定量結果判斷，分別對鏡下陽性表達的百分比和染色強度給予評分。①陽性細胞著色細胞數：每張切片上觀察5～10個高倍鏡視野(×100)，計數陽性細胞百分比，陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。②陽性細胞著色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③上述兩者計分相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。其中，定義0～4分為VASH-2低表達，5～12分為VASH-2高表達。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)表達依據2010年美國臨床腫瘤學會的標準判讀。人表皮生長因子-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2 )表達依據2013年美國臨床腫瘤學會/美國病理學家學會乳腺癌HER-2檢測指南判讀，其中免疫組化結果提示HER-2蛋白(++)的樣本需再行熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測明確HER-2表達狀態。

1.4 觀察指標 比較乳腺癌組織及癌旁組織VASH-2表達情況；比較乳腺癌組織VASH-2在乳腺癌富血供病灶和乏血供病灶中的表達情況；搜集患者臨床資料，比較不同病理參數(年齡、淋巴結是否轉移、腫瘤分期、ER表達、是否絕經及腫瘤細胞學分級、腫塊大小、分子分型、HER-2表達情況)乳腺癌患者VASH-2表達量的差異。

隨訪截至2019年1月，中位隨訪時間38個月(8～60個月)，采用Kaplan-Meier 法分析乳腺癌病灶中不同VASH-2表達情況對患者5年無病進展生存期(progression-free survival，PFS)的影響。

2 結果

2.1 VASH-2 蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達情況 免疫組化染色結果顯示，VASH-2蛋白主要分布在細胞質中，呈棕黃色染色顆粒。VASH-2在乳腺癌病灶中多呈高表達，表達率為52.43%(97/185)，而在癌旁組織中表達率為27.03%(50/185)，差異有統計學意義(χ=24.933,

P

<0.001)。見圖1。

圖1 VASH-2在乳腺癌不同區域組織中表達情況 (SP×100)

2.2 VASH-2蛋白在乳腺癌富血供和乏血供病灶中的表達情況 免疫組化染色結果顯示，VASH-2在乳腺癌病灶中富血供區域多呈高表達，表達率為60.82%(59/97)，而在乏血供區域表達率為38.64%(34/88)，差異有統計學意義(χ=9.087,

P

<0.05)。見圖2。

圖2 VASH-2在乳腺癌組織富血供和乏血供區域中的表達情況 (SP×100)

2.3 不同臨床病理參數患者VASH-2蛋白表達情況比較 不同腫塊大小、分子分型及HER-2是否陽性的乳腺癌患者VASH-2表達情況比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表1。2.4 VASH-2表達情況與患者預后的關系 Kaplan-Meier法生存分析結果顯示，VASH-2低表達組5年PFS優于VASH-2高表達組，差異有統計學意義(

χ

=5.635,

P

=0.018)。見圖3。

表1 不同臨床病理參數患者VASH-2蛋白表達情況比較

圖3 VASH-2高表達和低表達組5年PFS比較

3 討論

近年來乳腺癌發病率逐年升高，已成為中國婦女最常見的惡性腫瘤，部分乳腺癌具有惡性程度高、易內臟轉移、5年總生存率低等特點。腫瘤血管形成促進了腫瘤細胞增殖并形成了腫瘤細胞轉移的通道，氧氣和營養成分通過新生血管到達腫瘤細胞，直接影響腫瘤的發展進程。有研究發現惡性程度較高的乳腺癌多有豐富的血流及豐富的淋巴管網，腫瘤細胞通過血管及淋巴管出現淋巴結及血道遠處轉移。血管新生相關因子VASH-2在腫瘤血管生成過程中發揮了積極作用。相關基因表達分析研究結果顯示，VASH-2是一種新發現的血管新生影響因子，在多種腫瘤如肝細胞癌、胃癌和胰腺癌等癌細胞中均有表達。研究表明VASH-2在人和小鼠胚胎發育期的內皮細胞中表達，出生后表達消失；VASH-2促使人乳腺癌細胞進行上皮-間質轉化。因此，降低癌細胞中VASH-2的基因表達在理論上能明顯控制癌細胞生長和腫瘤血管生成。

本研究結果顯示，VASH-2表達情況在富血供乳腺癌組織和乏血供乳腺癌組織中存在差異(

P

<0.05)。正常情況下，VASH-2促進血管生成；隨著腫瘤發生發展，腫瘤細胞能夠分泌更多VASH-2因子促進血管生成，血管向腫瘤病灶延伸，腫瘤通過血管獲取更多養分及通過血管通道轉移。這提示VASH-2與乳腺癌的進展密切相關。分析原因可能是血管生成增加導致腫瘤細胞通過血管通道出現轉移，或通過血運轉移促進疾病進展，提示VASH-2可以作為預測乳腺癌惡性程度的標志物。有研究發現，VASH-2異常表達和肝癌、食管癌預后相關。本次研究結果發現，在乳腺癌病灶中VASH-2低表達組的5年PFS優于VASH-2高表達組 (

P

=0.018)，這與部分學者研究結果一致。關于VASH-2異常表達影響患者預后的具體機制，有待后續研究進一步探討。本研究還發現，不同腫塊大小、分子分型及HER-2是否陽性的乳腺癌患者VASH-2表達情況比較，差異顯著(

P

<0.05)。提示VASH-2異常表達和乳腺癌分子分型相關，VASH-2在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)中多呈現高表達，這可能與TNBC容易發生內臟轉移密切相關。

綜上所述，乳腺癌病灶中VASH-2 表達量明顯高于癌旁病灶，且富血供病灶中VASH-2的表達量高于乏血供病灶，其高表達可能與乳腺癌血管生成相關，VASH-2表達情況和乳腺癌預后相關。本實驗為回顧性小樣本研究，且可能存在研究過程中隨訪樣本不足，復發、轉移或死亡的樣本數較少，存在檢驗誤差等，因此VASH-2在乳腺癌中所起的作用仍需以后更多的臨床大樣本研究證實。