藏族冠心病患者腸道短鏈脂肪酸與菌群 血脂的相關性

劉鳳云 馬 焱 談月琴 侯海文 李 媛 李愈嫻

近年研究發現，腸道菌群與冠心病存在直接或間接的關系，其代謝產物特別是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)與肥胖、高血壓和心血管代謝性疾病等相關。藏族是高原寒冷缺氧環境的世居民族，長期以高脂高蛋白飲食為主，高血壓患病率顯著高于漢族，但冠心病患病率卻較低，血脂紊亂也以膽固醇紊亂為主,目前正常人群及冠心病人群的腸道菌群及短鏈脂肪酸研究多以漢族為研究對象，因腸道菌群存在明顯的種群、地域差異，結果可能并不適合藏族人群。藏族冠心病患者菌群代謝產物及其代謝產物短短鏈脂肪酸與健康人群有何不同，與血脂水平有何關系鮮有報道。本研究旨在分析藏族冠心病患者腸道短鏈脂肪酸、腸道菌群、血脂的變化及其間的相關性來探討短鏈脂肪酸與藏族冠心病的關系，為其個性化的非藥理學預防冠心病提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年8月至2018年2月就診于青海省心腦血管病專科醫院冠心病科并接受心臟CT和冠脈造影檢查的藏族心血管疾病患者30例為研究對象。其中，男性27例，女性3例，平均年齡(53.17±8.04)歲。根據冠脈造影或冠脈CT檢查結果將患者分為冠心病(coronary heart disease，CHD)組18例(至少1根主要冠狀動脈血管或其分支狹窄≥50%)和非冠心病(non coronary heart disease，NCHD)組12例(無冠脈狹窄或冠脈狹窄<50%者)。納入標準：年齡25～70歲，海拔3 000米及以上的世居藏族，近期有心絞痛或類似心絞痛發作，接受冠狀動脈造影或冠脈CT檢查及靜脈血檢測標本采集。排除標準：出血性卒中者；嚴重的肝、腎功能異常者；嚴重的心力衰竭者；惡性腫瘤者；感染或活動期免疫疾病以及完善相關檢查后考慮以上疾病者；排除3個月前使用任何制酸劑、益生菌、抗生素或抗微生物制劑者；消化系統有其他急慢性炎癥性疾病影響腸道菌群者。另外選取同期住院患者陪同家屬中身體健康，排除冠心病、高血壓、糖尿病等心血管病史，無嚴重或未控制的慢性病，居住地海拔3 000米及以上的世居藏族為健康對照組(healthy tibetans，HT),其中男性10人，女性13人，平均年齡(41.52±9.60)歲。本研究獲得醫院倫理委員會批準，3組研究對象均簽署書面知情同意書。

1.2 樣品采集 3組研究對象均采用普通生化管采集清晨空腹靜脈血液，離心3 000 r/min,10 min后取血清，收集清晨早餐前的新鮮糞便樣本并分裝于凍存管中, 分別將血清和糞便樣品置于-80℃冰箱中保存備用。

1.3 短鏈脂肪酸及血液生化指標檢測 糞便中菌群代謝產物短鏈脂肪酸的檢測采用全自動氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 7890 /5975C -GC /MSD, Agilent Technologies, California, USA)進行檢測，根據保留時間和曲線下面積計算樣品中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的含量。應用全自動血液生化分析儀(Olympus Au2700)對血液樣品中總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)等血脂水平進行檢測。

1.4 糞便DNA提取及16S rDNA 基因擴增 采用QIAamp DNA糞便Mini試劑盒(QIAGEN, Dusseldorf, Germany)提取糞便總DNA。DNA純化采用QIAamp迷你自旋柱按標準方法進行。采用NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)測定DNA濃度。利用引物擴增16S rDNA的V3和V4區。引物為 341F(5’- CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’- GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’) ，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)采用Prime STAR HS DNA Polymerase。PCR產物經QuantiFluorTM (Promega Biotech, Madison, Wisconsin, USA)熒光儀定量純化后，HiSeq 2500雙端測序。由廣州賽哲生物科技股份有限公司進行測試分析。

1.5 觀察指標 記錄并比較3組研究對象的下列指標：①血脂水平，總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C；②糞便短鏈脂肪酸水平：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸；③腸道菌群中屬水平菌屬的相對豐度：使用RDP比對注釋軟件，對糞便16SrDNA測序結果進行物種注釋。不同的16SrDNA生物拷貝數不同，在Meta 16S分析時得到是相對豐度，即每個菌屬的原始豐度除以該菌所在樣本的總菌屬豐度得到標準相對菌屬的相對豐度，使用相對豐度可以一定程度抵消拷貝數不同和樣品間的數量差別。本研究在屬水平上對3組研究對象的腸道菌群進行了比較，僅將代表性的有差異的菌屬的相對豐度列出。

2 結果

2.1 3組研究對象糞便短鏈脂肪酸水平及血脂水平比較 3組研究對象的年齡、性別比較，差異具有統計學意義(

P

<0.05)，后續比較時需矯正年齡與性別。3組研究對象的HDL-C水平比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)，與HT組比較，CHD組和NCHD組HDL-C降低，差異有統計學意義(

P

<0.05)。3組研究對象的糞便短鏈脂肪酸水平組間差異無統計學意義(

P

>0.05), 但與HT組比較，NCHD組糞便中異丁酸水平升高，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 3組研究對象血脂及糞便短鏈脂肪酸水平比較

2.2 3組研究對象腸道菌群中屬水平菌屬相對豐度比較 3組研究對象的小類桿菌屬(

Dialister

)和勞特氏菌屬(

Blautia

)的相對豐度比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。與HT組相比，CHD組和NCHD組小類桿菌屬的相對豐度顯著降低，勞特氏菌屬的相對豐度顯著升高，差異有統計學意義(

P

<0.05)。3組研究對象的普氏菌屬(

Prevotella

)和擬桿菌屬(

Bacteroides

)相對豐度比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)，但CHD組擬桿菌屬相對豐度較NCHD組顯著降低(

Z

=-2.074,

P

=0.038)。見表2。

表2 3組研究對象腸道菌群中屬水平菌屬相對豐度比較

2.3 糞便支鏈短鏈脂肪酸異丁酸與差異性血脂、腸道菌群的相關性分析 CHD組異丁酸含量與HDL水平顯著正相關(

r

=0.808,

P

<0.01)，NCHD組異丁酸含量與

Blautia

菌屬相對豐度顯著正相關(

r

=0.627，

P

=0.039),HT組異丁酸含量與

Prevotella

普氏菌屬顯著負相關(

r

=-0.438,

P

=0.047)，與

Blautia

布勞特菌屬顯著正相關(

r

=0.467,

P

=0.033)。見表3。

表3 三組研究對象中有差異的血脂參數、屬水平腸道菌群與異丁酸的相關性

3 討論

通常在人類大腸中有總濃度為50～200 mM的短鏈脂肪酸，乙酸、丙酸、丁酸是研究較多的3種主要短鏈脂肪酸，其水平與血壓顯著相關，也可以起到抗肥胖、抗糖尿病、保護心血管的作用。支鏈短鏈脂肪酸如異戊酸和異丁酸是支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等分解代謝過程中產生的少量代謝產物，其發揮作用的組織、受體及對宿主的生物學影響尚不清楚。藏族人群特別是藏族冠心病患者腸道短鏈脂肪酸水平目前少有研究。

本研究發現,與HT組相比，CHD組腸道短鏈脂肪酸水平沒有顯著變化，而NCHD組腸道中異丁酸含量顯著升高。以往研究表明，短鏈脂肪酸水平升高有益于高血壓心血管疾病患者，但CHD組和NCHD組中合并高血壓患者比例并沒有顯著性差異，說明異丁酸水平與藏族冠心病危險因素攜帶者特別是高血壓患者是否容易發展為冠心病可能無關。異丁酸在心血管疾病中的作用未見報道，異丁酸升高的具體作用還需要動物實驗及臨床大樣本數據的支持。

短鏈脂肪酸的產生是大腸腸腔內發生的發酵反應，產生短鏈脂肪酸的細菌主要包括厭氧類桿菌、雙歧桿菌、真細菌、鏈球菌和乳酸桿菌。本研究對與藏族腸道異丁酸含量的改變有關的細菌種屬進行了分析，發現與HT組相比，CHD組

Dialister

菌屬相對豐度顯著降低，

blautia

菌屬相對豐度顯著升高，它們與糞便中異丁酸的含量并不相關，說明CHD組這兩種菌屬的改變與異丁酸的水平無關。NCHD組

Prevotella

、

Dialister

、

Blautia

菌屬的相對豐度也發生了改變，但只有

Blautia

菌屬的相對豐度與腸道中異丁酸水平顯著正相關，在HT組中也存在這種正相關關系，CHD組中不存在，說明菌群與異丁酸的相關關系在CHD組中已經發生了紊亂，這種改變與

Blautia

菌屬密切相關,這可能是一個新發現。目前并沒有查到與異丁酸濃度相關的菌群文獻，現有文獻中有檢測糞便異丁酸水平的，但沒有發現有微生物組與異丁酸鹽濃度顯著相關。

CHD組與NCHD組血液中HDL水平相比于HT組均顯著降低。HDL在體內負責膽固醇運輸到體內以免在血管內沉積，HDL降低說明膽固醇在血管壁沉積增加，結果與藏族病患臨床冠脈硬化狹窄特征相符。CHD組HDL水平與糞便中異丁酸的含量顯著正相關，但CHD組異丁酸水平與對照組相比沒有顯著性差異，可能異丁酸改變與HDL降低沒有直接聯系。

綜上所述，藏族冠心病患者腸道菌群組成、血脂發生改變，且菌群與短鏈脂肪酸的相關關系發生了紊亂。藏族心血管疾病危險因素攜帶者(NCHD組)糞便支鏈短鏈脂肪酸異丁酸水平顯著升高，且與腸道中Blautia菌的相對豐度顯著相關。支鏈短鏈脂肪酸異丁酸水平與高血壓、冠心病的關系需進一步的分子生物學及動物實驗的驗證。