家蠅Actin-5C基因啟動子的生物信息學分析及載體構建*

王藍晨，王昱，王穎，楊仕賽，朱貴明

(貴州醫科大學 生物與工程學院 實驗中心，貴州 貴陽 550025)

家蠅(MuscadomesticaL.)屬于完全變態昆蟲，是世界大部分地區最常見的一種昆蟲[1]。家蠅具有生育能力強、生命周期短、易于高密度培養等特點，且育種技術簡單，飼料來源豐富，已被列為世界上新的蛋白質資源昆蟲[2-4]。因此將家蠅作為一種新型的轉基因生物反應器進行研究，具有廣闊的發展前景。昆蟲轉基因技術是利用功能基因開發新昆蟲品種的關鍵，也是實現昆蟲有用蛋白質合成和生物反應器開發的關鍵技術[5-6]。外源基因能否成功表達，啟動子的選擇顯得尤其重要[7]。目前，對家蠅的轉基因研究相對不成熟，技術體系的建立尚不完善，仍缺乏能夠實現外源基因高效表達的理想啟動子。在果蠅和家蠶中，肌動蛋白(Actin)是一種具有收縮特性的高度保守的組成型蛋白[8]，肌動蛋白除存在于肌肉細胞中，還是細胞骨架的重要組成部分、參與細胞遷移、染色體分離及細胞內大分子轉運等[9]。肌動蛋白5C(Actin-5C)屬細胞質肌動蛋白，通常認為將它祝為表達外源目的基因的啟動子比較合適[10-11]。本研究使用多種預測工具預測Actin-5C啟動子區，并克隆預測調控區域，重組到含螢火蟲熒光素酶的報告基因pGL3-Basic載體上，為進行下一步的實驗研究篩選出啟動子活性最強的家蠅Actin-5C啟動子的調控區域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1家蠅及細胞來源 供試蟲源家蠅由貴州醫科大學生物與工程學院昆蟲房飼養，溫度25～28 ℃，濕度70%，光照周期12 L ∶12 D。供試細胞sf9(草地貪夜蛾)為貴州醫科大學生物與工程學院實驗室保存。家蠅幼蟲經麥麩飼養，家蠅成蟲以白糖和奶粉以1 ∶1比例混合進行飼養，飲用水為無菌蒸餾水。

1.1.2主要試劑 熒火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic和pGL3-Promoter購于美國Promega公司，Q5?超保真2× 預混液、限制性內切酶及T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，DNA Marker、純化回收試劑盒及2×TaqPCR MasterMix Ⅱ購自天根生化科技(北京)有限公司，氯化鈉、酵母粉及胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，瓊脂糖購自中國biosharp公司，DNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自德國PAA公司，Grace′s昆蟲培養基和細胞轉染試劑購自美國Thermo ScientificTM公司。Primer 5.0設計引物(表1)、引物合成及基因測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 PCR實驗中使用的引物Tab.1 Primers used in PCR experiments

1.1.3主要儀器 Applied Biosystems PCR儀購自美國Thermo ScientificTM公司，DYY-BC型電泳儀購自北京市六一儀器廠，Milli-Q超純水儀購自德國Millipore Pharmacia，超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術公司。

1.2 方法

1.2.1啟動子分析 在美國國家生物信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數據庫中檢索家蠅肌動蛋白Actin-5C基因gDNA序列，使用生物信息學預測工具分析得到啟動子區，其中啟動子轉錄起始位點預測使用的是Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)，啟動子預測分析使用伯克利果蠅基因組計劃(berkeley drosophila genome project,BDGP)在線分析軟件，以及Softberry 啟動子預測分析工具包(包括TSSG、TSSP和FPROM)，轉錄元件的預測使用的是Cister(https://zlab.bu.edu/～mfrith/cister.shtml)。

1.2.2熒光素酶載體構建 Primer 5.0軟件進行引物設計，DNASTAR軟件行酶譜分析，在上游和下游引物5′端分別引入XhoⅠ和KpnⅠ限制性內切酶酶切位點和保護堿基(表1)。提取家蠅成蟲DNA并以此為模板，采用超保真聚合酶擴增相應的目的片段。PCR條件為98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，共35個循環，最后4 ℃保存。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物。XhoⅠ和KpnⅠ內切酶雙酶切PCR產物及載體pGL3-Basic純化回收后進行連接反應，得到的質粒分別命名為pGL3-1156、pGL3-1745及pGL3-2059三種質粒，重組質粒經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切及測序進行鑒。

1.2.3瞬時轉染細胞及熒光素酶基因的表達 取sf9細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板中，細胞90%融合時，加無血清無雙抗Grace′s培養基100 μL/孔，再加空載體pGL3-Basic和pGL3-Promoter各4 μg作為對照組，pGL3-1156、pGL3-1745及pGL3-2059各4 μg為實驗組，轉染時加內參載體phRL-TK400 ng和Lipofectamine2000 10 μL，補充無血清無雙抗的培養基250 μL，置28 ℃ 孵箱培養。6 h后棄培養液，換完全培養基。24 h后提取細胞總RNA，反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測螢火蟲熒光素酶基因的表達情況，上游引物Fluc-F為5′ TGCCTCATAGAACTGCCTGCGTG 3′，下游引物Fluc-R為5′ TATCATCCCCCTCGGGTGTAATCAG 3′。PCR擴增時64 ℃退火，延伸40 s，循環30次，產物長度為420 bp；并以βactin作為內參照，上游引物βactin-F為5′ GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC 3′，下游引物βactin-R為5′ TGTCACGCACGATTTCCCTCTC 3′，PCR擴增時62 ℃退火，延伸10 s，循環30次，產物大小約為250 bp。結束后取反應液5 μL進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統檢測PCR產物。

2 結果

2.1 家蠅Actin-5C基因定位及啟動子分析

在線軟件NCBI對Actin-5C(NW_004766441)基因結構進行分析，結果顯示Actin-5C基因在GenBank數據庫中位于Scaffold 20349上，基因全長為5 359 bp。使用BDGP在線分析Actin-5C基因啟動子，以Actin-5C基因轉錄起始密碼子(ATG)的第一個堿基A作為+1，Actin-5C基因5′端上游-2 609～-94 bp區域內有啟動子活性，且啟動子分值達0.8以上，其中-2 198～-2 148 bp時的分值最高，達到0.98(表2)。使用軟件TSSG、TSSP、Promoter 2.0和FPROM預測Actin-5C啟動子基因序列，將預測結果匯總后制圖(圖1)。使用Cister預測轉錄元件，在-220 bp處檢測到CAAT盒信號；在-1 444 bp處檢測到TATA盒信號(表3)。經比較取最有可能的1 156 bp(-1 236～-80 bp)、1 745 bp(-1 825～-80 bp)和2 059 bp(-2 139～-80 bp)截斷啟動子片段構建pGL3-1 156、pGL3-1 745及pGL3-2 059三種質粒。

表2 BDGP啟動子預測工具預測Actin-5C基因非編碼區序列中的啟動子Tab.2 BDGP promoter prediction tool for Actin-5C promoter in non-coding region sequence

圖1 多種啟動子預測軟件預測Actin-5C基因啟動子Fig.1 A variety of promoter prediction software to predict the Actin-5C gene promoter

表3 Cister預測轉錄元件列表Tab.3 Cister predictive transcriptome list

2.2 家蠅Actin-5C轉基因載體的構建

提取家蠅基因組DNA，并根據已經報道的Actin-5C基因預測啟動子區，以家蠅基因組DNA為模板進行PCR反應，PCR產物與載體pGL3-Basic經同樣的酶切回收，回收片段大小分別為1 156、1 745及2 059 bp，片段大小正確；將回收后的目的片段連接到報告基因pGL3-Basic載體上，轉化篩選單克隆并提取陽性重組質粒，得到的重組質粒pGL3-1 156，pGL3-1 745，pGL3-2 059，片段大小正確；經Blast比對分析結果顯示堿基序列正確，表明重組質粒構建成功。見圖2和圖3。

圖3 重組質粒的測序結果(節選)Fig.3 Sequencing results of recombinant plasmids(Excerpt)

2.3 熒光素酶編碼基因的轉錄檢測

將3個重組質粒轉染sf9細胞后RT-PCR逆轉cDNA，以cDNA為模版檢測熒光素酶編碼基因，轉錄結果表示3個重組質粒載體轉錄成功(圖4)。

注：A為家蠅基因組DNA，B為酶切PCR產物，C為重組質粒，D為雙酶切鑒定；M為DNA分子量標準Marker。圖2 啟動子重組質粒構建Fig.2 Construction of recombinant plasmid using promoter

注：A為RT-PCR檢測結果，B為內參；M為DNA分子量標準Marker，1為陰性對照，2為未轉sf9，3為pGL3-Basic，4為重組質粒pGL3-1156，5為重組質粒pGL3-1745，6為重組質粒pGL3-2059，7為陽性質粒pGL3-Promoter。圖4 RT-PCR檢測重組質粒Fig.4 RT-PCR detection of recombinant plasmids

3 討論

具有轉錄起始特異性的啟動子是位于結構基因5′末端上游的非編碼DNA序列，可以活化RNA聚合酶并使RNA聚合酶精確結合DNA模板，是基因轉錄調節的核心區域[12-13]；真核生物啟動子在轉錄調節中有著非常重要的作用，是RNA聚合酶特異性結合位點的轉錄調控元件[14-15]。利用生物信息學預測啟動子，對于基因轉錄調控機制的研究這是一種重要的方法，它可以有效地從基因組中找到已知和未知的轉錄調控元件，為基因結構和功能的研究提供可靠的依據[16-17]。在真核基因表達調控系統中，基因轉錄的起始和調控主要通過順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶的協同作用實現[18]。順式作用元件在起始位點和基因轉錄的轉錄效率中起決定性作用[19]，并且基因的轉錄起始通常通過啟動子實現[20]。啟動子序列由核心元件TATA盒、正向核心啟動子元件BRE、反向啟動子元件DPE、啟動子、CAAT盒和GC盒組成，這些都是通過生物信息學研究啟動子的重要信息[21-23]。本研究在NCBI數據庫對Actin-5C基因結構定位分析，對Actin-5C基因5′端正向3 898 bp序列進行分析，發現該基因的啟動子區和核心啟動子區；利用Promoter 2.0軟件預測該基因的轉錄起始位點；通過Cister軟件預測，對非編碼區序列進行分析，發現Actin-5C基因有TATA盒信號，也有CAAT盒信號，經預測評分初步確定Actin-5C啟動子的核心區域。

研究啟動子需要生物信息學預測工具或軟件，它可以大大簡化理解基因的過程，通過預測和基因比對，人們可以更充分地了解基因及其編碼的蛋白質[24]。生物信息學預測工具或軟件等作為指引科研實驗方向的輔助工具，其結果必須經過實驗研究進一步證明[25-26]。目前常借助一些報告基因如雙熒光素酶報告基因(luciferase)、綠色熒光蛋白報告基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)等瞬時表達，根據報告基因的表達情況，確定啟動子中的一些相應元件的部位、功能及特性[18,27]。

對于家蠅分子生物學的研究與蠶、果蠅等昆蟲相比，其理論研究不夠深入，比如基因組特點、功能等，基因的表達調控是其發揮生物功能、調節機體生命過程的基礎，而啟動子是表達調控的關鍵，構建新的家蠅啟動子片段報告基因載體是成功進行轉基因家蠅研究的必要條件。本研究將Actin-5C基因生物信息學分析得到的結果，根據基因啟動子的分析，克隆并成功構建不同啟動子片段報告基因載體，為分析家蠅轉基因載體的表達特征、家蠅轉基因細胞系的建立以及轉基因家蠅的養成奠定了基礎，為研究Actin-5C基因啟動活性及轉錄調控元件，探討基因表達調控機制提供了實驗依據。轉基因家蠅是一個大工程，啟動子效率的研究尤為重要，實驗至此構建的3個重組質粒載體，初步檢測均具有活性，為今后實驗篩選出最強啟動子提供了條件，具有重要意義。