梗阻性黃疸大鼠脂質代謝及肝型脂肪酸結合蛋白的變化*

李福堂，王惠群，楊大剛，孫誠誼，郭平平

(1.貴州醫科大學附屬白云醫院 肝膽外科,貴州 貴陽 550000；2.貴州醫科大學 公共衛生學院，貴州 貴陽 550000；3.貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550000)

梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ) 是肝膽外科常見疾病，是指肝內毛細膽管、小膽管、肝膽管、肝總管或膽總管的機械性梗阻，導致膽汁排泄障礙、膽汁淤積，整個膽道系統壓力增高，膽紅素逆流入血而形成的組織黃染，主要病因是膽石癥和惡性腫瘤[1]。梗阻性黃疸病人可引起機體各器官的損害，其中肝臟損害最為嚴重，其損害機理包括胃腸道細菌移位和內毒素血癥[2]、氧自由基的損傷作用[3]、能量代謝障礙[4]、機體免疫功能受損[5]、肝細胞凋亡[6]以及鈣穩態失調等，其中氧自由基的損傷及能量代謝障礙在OJ的脂質代謝中起重要角色，脂質過氧化是OJ器官損傷的最重要的機制之一。肝型脂肪酸結合蛋白(liver type fatty acid binding protein，L-FABP)在OJ過程中的表達與游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)代謝及肝臟氧化應激損傷密切相關，因此了解梗黃過程中脂質代謝及L-FABP的變化對OJ患者的臨床治療具有重要意義，而OJ的脂質代謝及L-FABP變化的研究鮮有報道。因此本研究期望通過建立OJ大鼠模型，檢測在OJ發生及進展過程中脂質代謝及L-FABP的變化，探討L-FABP在其中的作用，為OJ患者的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器、試劑

選取54只體質量為(280±30)g的健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，由貴州醫科大學動物中心提供[許可證號SCXK(黔)2018-0001]；德國西門子公司西門子ADVIA2400全自動生化分析儀(德國西門子公司)，總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)，上海科華東菱診斷用品有限公司甘油三脂檢測試劑盒(上海科華東菱診斷用品有限公司)，Rat low density lipoprotein(VLDL、FFA、OxLDL、Lp-X、L-FABP)ELISA Kit(美國R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 大鼠適應性喂養1周后，完全隨機分成正常對照組(A組)、假手術組(B組)和膽總管結扎組(C組)共3組，每組18只。C組大鼠，均采用10%水合氯醛按3 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定、備皮，每組取6只大鼠，碘伏、75%乙醇消毒手術野；正中切口約3 cm，解剖肝蒂，游離出膽總管后，以2-0號絲線雙重結扎膽總管，關閉腹膜腔，切開處常規消毒；B組,大鼠僅游離膽總管，不結扎，其余操作同C組；A組，不作任何處理。分別于術后第5、12和19天，每組取6只大鼠固定后，切開一側腹股溝部位的皮膚，分離暴露股動脈，再用血管鉗將其挑起，用剪刀剪斷血管后直接用常規生化試管及帶有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管取血，每只大鼠采全血3～4 mL檢測下列指標。

1.2.2大鼠一般情況及肝臟組織肉眼觀察 觀察3組大鼠3個時間點的一般情況(大鼠的精神、食欲、皮膚及鞏膜的顏色、大小便顏色)、解剖后膽總管結扎部位以及肝臟顏色、硬度。

1.2.3檢測指標及方法 谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、甘油三脂(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)用西門子ADVIA2400全自動生化分析儀測定。肝型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)、氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)、游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)、阻塞性脂蛋白X(lipoprotein X，LPx)分別按照ELISA試劑盒說明書測定。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況觀察和肝臟組織肉眼觀察

觀察整個實驗過程中A、B、C組一般情況，A組大鼠一般情況及肝臟組織肉眼觀察無特殊；B組術后1～4 d僅有食欲不振，精神稍差，體重稍減少，后逐漸恢復和A組一樣；C組術后2～3 d，大鼠出現皮膚、鞏膜黃染并逐漸加深，尿色深黃，食欲減退，體質量逐漸減輕。開腹后見A組和B組腹腔無特殊,而C組大鼠可見術后5 d近肝門部膽總管囊狀擴張充滿膽汁，術后12 d肝臟彌漫性腫大、呈黃褐色，術后19 d肝臟質地變硬。見圖1。

2.2 術后第5天血清LPx、ALT、AST、TBIL及DBIL

C組大鼠血清LPx、ALT、AST、TBIL及DBIL表達高于A組和B組，差異有統計學意義(P<0.05)；而B組與A組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

注：a為A組正常肝臟組織；b為A組正常的膽總管；c為B組肝臟；d、e為術后5 d膽總管及肝臟，結扎后膽總管囊性擴張，肝臟呈黃褐色；f為術后12 d膽總管及肝臟；g為術后19 d膽總管及肝臟。圖1 A、B、C組肝臟組織肉眼觀察Fig.1 Visual inspection of hepatic tissue of rats in Goup A ,B,and C

表1 各組大鼠血清中LPx、ALT、AST、TBIL及DBIL的變化Tab.1 Comparison of serum LPx,ALT,AST,TBIL,and DBIL of rats in each

2.3 血脂指標

結果顯示，術后第5天，C組TC、TG、HDL以及LDL明顯高于A組及B組，差異有統計學意義(P<0.01)。術后第12天，C組TC、LDL高于A組及B組，差異有統計學意義(P<0.05)。術后第19天，C組TC、LDL、VLDL、Ox-LDL高于A組和B組，差異有統計學意義(P<0.05)，而FFA低于A組和B組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血脂指標的變化Tab.2 Changes in lipid profile of rats in each group

2.4 血清L-FABP水平

術后第5天和第12天，C組術后血清中L-FABP高于A組及B組，差異具有統計學意義(P<0.05)；術后第19天，A組與C組、B組與C組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠3個時間點L-FABP水平Tab.3 Changes of serum L-FABP of rats in each group at three time points

3 討論

膽道結扎術后5 d，C組大鼠的TC明顯增高，其原因為：(1)膽汁酸能反饋抑制7a-羥化酶,抑制膽汁酸合成,使TC代謝去路受阻,在血中積聚；(2)膽道壓力增高[7],TC隨膽汁逆流入血,使血中TC 的含量增高;(3)梗阻性黃疸，肝功能受損，肝臟合成膽紅素減少，消耗膽固醇減少。血清總膽固醇升高，隨著梗阻時間延長，膽總管內壓力不斷增加，膽管直徑不斷增寬，當膽管內壓力同膽管壁的回應力相等時，膽管內壓力不再增加[8]，致使TC隨膽汁逆流入血減少，同時體內消耗部分TC；(4)L-FABP在肝中膽固醇聚集有重要調節作用[9],此為C組術后12和19 d時逐漸下降原因所在。正如Martin等[10]用敲除L-FABP雄性小鼠研究發現高膽固醇膳食后，L-FABP可能成為雄性小鼠膽汁酸合成、肝中膽固醇聚集的重要調節因素。

膽道結扎術后第5天C組血清中TG明顯增高，后逐漸降低，第12、19天降為正常；研究表明，TG在梗阻早期是增加，L-FABP的基因多態性也可造成TG升高[11]，肝臟嚴重損害后TG降低。梗阻性黃疸病人還同時存在高TG血癥，可能與TG血清清除率降低有關[12]。血清中FFA逐漸減少，原因為：(1)膽總管結扎后食欲不振，造成攝入不足；(2)膽道梗阻時，膽汁不能順利排入腸道，胰脂肪酶無法被激活，導致脂肪消化吸收不良；(3)脂肪動員加速，使體內FFA減少。L-FABP膜間的脂肪酸轉運需要3步，供體膜分離、水相擴散和受體膜連接，每步都是雙向可逆的，其由供體到受體膜轉運脂肪酸的轉運有3種機制[13]:(1)脂肪酸自動發生轉運,但其轉運率很低；(2)由非膜激活型受體協助,擴散是通過增加溶解的脂肪酸濃度來進行的；(3)由膜激活型受體介導發生,促進與受體膜作用過程中的分離與重新結合。

TC在血液中與載脂蛋白(apo)結合，以可溶性脂蛋白的形式存在，其中3/4存在于LDL中，1/4存在于HDL中[14],故HDL、LDL與TC的變化趨勢相似，膽道結扎術后5 d時C組血清中含量最高，后逐漸下降，LDL占TC量多，LDL降低緩慢。LDL在膽道結扎術后5 d時升高還與梗阻性黃疸時血清中出現異常LDL即脂蛋白x有關。HDL的代謝受許多生理和病理條件的影響，在梗阻性黃疸病人，肝靜脈系統內的膽鹽濃度遠遠高于可造成細胞損害的濃度(3～6 mmol/L),因此膽鹽破壞效應增強，HDL穩定性降低[15]。梗阻性黃疸時卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)活性降低、合成減少,使膽固醇酯化出現障礙，HDL生成減少。HDL與脂多糖(LPS)的結合能有效地封閉LPS的活性中心，競爭性抑制LPS與其受體結合，降低LPS對靶細胞的激活作用，減少炎癥介質的釋放，從而緩解LPS引起的炎癥反應[16],這個機制會使HDL分解增加、濃度下降，而且HDL降幅與疾病嚴重程度相關[17]。

膽總管結扎術后第5天和12天，C組Ox-LDL與A組及B組無明顯差異，隨梗阻時間延長，肝臟損害加重，術后第19天時梗阻性黃疸大鼠出現肝硬化，C組Ox-LDL明顯高于A組及B組。研究發現梗阻性黃疸改變了機體氧化應激的平衡狀態，能加劇肝臟纖維化的發展[18]。脂質是機體發生氧化應激的主要作用底物，而 Ox-LDL又是脂質氧化應激的產物，能誘導內皮細胞的功能紊亂和平滑肌細胞的增生。以往認為Ox-LDL是動脈粥樣硬化的重要危險因素[19],近年來研究發現 Ox-LDL能促進膠原纖維的降解，使細胞外基質發生紊亂，而肝臟的內皮細胞、巨噬細胞和枯否細胞中也存在 Ox-LDL特定的受體，Ox-LDL可能促進肝臟纖維化甚至誘導肝硬化[20]。

L-FABP是肝臟內唯一表達的脂肪酸結合蛋白，其結合并轉運脂肪酸。肝臟細胞中L-FABP主要在肝細胞胞質中,在正常血清中L-FABP含量較低,膽總管結扎后肝細胞受損，肝細胞膜通透性變化可使其快速溢出質量較小的L-FABP，釋放入血，使血漿L-FABP濃度上升，因此在術后5 d時L-FABP升高，并在12 d時達到高峰。隨梗阻性黃疸時間延長，肝臟嚴重損害時，肝臟合成分泌L-FABP減少，進而血漿中的L-FABP濃度減少，至19d時明顯低于5d與12d的濃度，與A組及B組無明顯差異。目前研究成果，L-FABP參與脂質代謝的調控機制主要有[21]：(1)通過對脂肪酸的調控來影響脂質代謝，將脂肪酸從細胞膜轉運到代謝場所，比如L-FABP結合長鏈脂肪酸并轉運至β氧化場所及磷脂和TG的合成部位；(2)影響脂質代謝酶的活性來調控脂質代謝，L-FABP增強脂質代謝酶的活性，提高對脂肪的吸收能力；(3)對激素的介導作用來影響脂質代謝；(4)L-FABP能維持FFA的平衡，L-FABP結合脂肪酸，使體內FFA維持相對平衡狀態；(5)L-FABP具有維持脂質代謝內環境的穩定，作為脂肪酸和胰腺輔酶A生化反應的輔助因子影響胞質內脂肪酸分室化，并緩沖輔酶A級長鏈脂肪酸對機體的副作用。

此外，L-FABP的改變與氧化應激狀態及抗氧化能力的改變有關，在梗阻性黃疸5～12 d時，為對抗氧化應激的加重，機體的L-FABP增加。Yan等[22]用L-FABP的cDNA轉錄模型證實了L-FABP有抗氧化活性，發現與缺乏L-FABP肝細胞比較，含L-FABP的肝細胞能更明顯減少細胞內活性氧的水平。Wang等[23]運用膽管結扎大鼠模型研究L-FABP在肝臟的表達及抗氧化作用，結果顯示L-FABP表達上升后，ROS水平降低，肝功能血清總膽紅素、谷丙轉氨酶等指標改善和血氨減少；在另一個將L-FABP基因轉染至張氏肝細胞的研究中，發現L-FABP可以減輕H2O2、缺氧所導致的氧化應激損傷，提示L-FABP在肝細胞氧化應激中有重要的抗氧化功能。L-FABP結構中有1個半胱氨酸和7個甲硫氨酸，具有抗氧化作用，這些殘基可參與巰基的氧化還原,提高還原性谷胱甘肽的生成率。除此之外，L-FABP對脂肪酸和脂質過氧化產物有高親和力和結合能力，發揮內源性抗氧化劑的重要作用，維持細胞內脂質的平衡[24]。在生理狀態下，FFA與白蛋白結合，在線粒體或過氧化酶體內氧化供能[25],在梗阻性黃疸，FFA可造成細胞內膜性結構如線粒體的腫脹等，還能形成ROS激活并誘導產生細胞因子，發生持續的肝細胞壞死和凋亡，并且加重肝細胞脂肪變性進展為脂肪肝，纖維化甚至肝硬化。L-FABP抗氧化作用及機制：在正常生理條件下，機體細胞內氧自由基與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶等抗氧化酶類系統保持動態平衡[26]，在梗阻性黃疸狀態下此動態平衡打破，L-FABP結構中的半胱氨酸結合疏水性配體，能有效清除自由基，或作為抗氧化劑參與S-硫醇化/去硫醇化[25]。L-FABP中的甲硫氨酸氧化成亞砜甲硫氨酸，抑制了肝細胞的氧化應激，同時把甲硫氨酸亞砜還原酶還原成甲硫氨酸。這一系列催化反應的凈化效果是活性氧轉化為無害產物，驅動NADPH氧化反應。在梗阻性黃疸中甲硫氨酸氧化-還原循環發揮著重要的抗氧化作用。此外，L-FABP與ROS反應來阻止磷脂氧化反應的擴大，從而保護細胞膜不被破壞，L-FABP還通過結合多不飽和脂肪酸來調節脂肪酸在細胞內氧化途徑的利用度，從而控制ROS的釋放量，同時L-FABP可能是通過調節FFA的代謝和發揮抗氧化作用來減輕氧化應激損傷[27]。L-FABP在梗阻性黃疸的脂質代謝起著重要調節作用，可為梗阻性黃疸患者的治療提供新的治療靶點。