美洲大蠊提取物對人肺腺癌HCC-2935細胞增殖和凋亡及周期的影響*

黃麗，康哲，翟素珍，張春林，蔡莉

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 生物學系，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市白云區醫院 婦產科，貴州 貴陽 550014)

肺癌是我國乃至全世界發病率和致死率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌中最主要的病理類型，占所有肺癌患者的80%～85%[1]，其治療亦是全球性的一大難題[2-4]。近年來，中藥治療與手術、放療及化療相比，具有多環節、多成分、多靶點效應及減毒增效的優勢[5-8]。美洲大蠊(periplanetaamericanaL.)俗稱“蟑螂”，是一種蜚蠊科昆蟲[9]。美洲大蠊入藥在《神農本草經》中已經記載[10]，至今以其為原料已研制出多種新藥，如心脈龍注射液、康復新液、肝龍膠囊及癥益肝片等[11]。眾多研究表明，美洲大蠊提取物(periplanetaamericanaextract,PAE)具有抗氧化、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等廣泛的藥理活性[12-14]。目前PAE在肺癌方面的研究少有報道[15]，且具體的作用機制尚不完全清楚。本研究以人LUAD HCC-2935細胞為研究對象，探究PAE對HCC-2935細胞增殖、周期及凋亡的影響，為PAE應用于LUAD的臨床治療提供新的基礎理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株與成蟲 人LUAD細胞株HCC-2935由貴州醫科大學分子生物學重點實驗室惠贈，美洲大蠊成蟲取自貴州醫科大學基礎醫學院生物學系蜚蠊養殖房，PAE經90%乙醇冷浸提取獲得。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI-1640培養基(美國Gibco)，胰蛋白酶和胎牛血清(美國Sigma)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒和細胞凋亡熒光Hoechst 33342/PI(propidium iodide，PI)雙染試劑盒(北京Solarbio)，順鉑(上海恒遠)；ELX808酶標儀(瑞士寶特)，BDS200倒置生物學顯微鏡(重慶奧特)，流式細胞儀(美國NovoCyte)，371直熱式CO2恒溫培養箱(美國Thermo)，QL 901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫用儀器)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分組 人LUAD細胞HCC-2935使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基，置于37 ℃的5%CO2培養箱內培養，使細胞均勻貼壁生長，取生長良好、形態均一的對數生長期細胞進行后續實驗，并分為對照組、PAE組及順鉑組。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期各組細胞調整為1×108個/L的細胞懸液，按100 μL/孔接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養箱內培養過夜；PAE組細胞中分別加50、100及200 mg/L PAE，對照組細胞加等體積濃度含血清的RPMI-1640培養基，順鉑組細胞加等體積濃度的40 mg/L順鉑，每個濃度設置5個副孔，培養24、48 h；每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續培養4 h后棄上清液，加DMSO 150 μL，震蕩混勻，酶標儀于490 nm處測定吸光度(optical density，OD)；每組重復3次實驗，計算各組細胞增殖抑制率[細胞增殖抑制率(%)=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%]，篩選出給藥的有效作用時間。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數生長期的各組細胞按2×105個/孔接種于6孔板，置于37 ℃的5%CO2培養箱中培養過夜；將不同濃度的PAE、含血清的RPMI-1640培養基和40 mg/L順鉑加入各組對應孔；給藥作用48 h后，采用胰酶消化并收集各組細胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次，分別加Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)各5 μL，室溫避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率；每組重復3次，取其細胞數的平均值。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期 將對數生長期的各組細胞按3×104個/孔接種于6孔板中，將不同濃度的PAE、含血清的RPMI-1640培養基和40 mg/L順鉑加入各組對應孔中；給藥處理48 h后，采用胰酶消化并收集各組細胞，PBS洗滌，用預冷的70%乙醇4 ℃固定過夜；PBS洗去殘留的乙醇，PI低于4 ℃的避光條件下細胞染色30 min，用流式細胞儀檢測各組細胞的生長發育周期變化。每組重復3次實驗，計算染色平均值。

1.3 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料組間比較使用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖

MTT法檢測結果顯示，與對照組相比，不同濃度的PAE組和順鉑組HCC-2935細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.01)；在同一時間點隨PAE濃度的增加，HCC-2935細胞增殖抑制率逐漸升高(P<0.01)；相同PAE濃度時，各組作用48 h的抑制效應較作用24 h明顯增強(P<0.01)，顯示PAE抑制HCC-2935細胞的增殖呈時間-劑量依賴性；24和48 h作用時間下200 mg/L PAE組HCC-2935細胞增殖抑制率較順鉑組明顯上調(P<0.01)。因此，在后續研究中選取給藥48 h作為研究的有效作用時間點。見表1。

表1 各組HCC-2935細胞增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of HCC-2935 cells in each

2.2 細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組比較，50、100及200 mg/L PAE組HCC-2935細胞凋亡率逐漸升高，呈劑量依賴性(P<0.01)；其中200 mg/L PAE組HCC-2935細胞凋亡率較順鉑組升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與順鉑組比較，P<0.01。圖1 各組HCC-2935細胞凋亡率 Fig.1 Effects of different concentrations of PAE on apoptosis of LUAD HCC-2935 cells

2.3 細胞周期

流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，40 mg/L順鉑組HCC-2935細胞于G0/G1期所占百分比升高，在S期和G2/M期的百分比降低(P<0.05)，表明細胞周期被阻滯于G0/G1期；50、100及200 mg/LPAE組HCC-2935細胞于G0/G1期和S期的百分比較對照組降低，在G2/M期細胞所占百分比較對照組升高(P<0.05)，推測細胞周期被阻滯于G2/M期。見圖2。

注：與對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.001。圖2 不同濃度PAE對HCC-2935細胞周期的影響Fig.2 Effect of PAE on the cycle of HCC-2935 cells

3 討論

目前LUAD的發病率和死亡率一直居高不下，主要在于其術后復發性高、耐藥性及高轉移性[16]。以順鉑為代表的鉑類聯合其他化療藥物是臨床治療LUAD的一線方案[17]，雖然多數患者在化療初期對藥物敏感，但后期療效欠佳，鉑類耐藥已成為臨床治療LUAD的難題[18]。因此，臨床迫切需要毒副作用低、治療效果好且逆轉耐藥的LUAD化療藥物。

美洲大蠊作為世界上最古老的昆蟲，能適應各種陰暗惡劣環境，在數億年的進化歷程中其體內必形成了獨特防御機制的某些特殊生化物質[19]。純天然蟲類中藥材美洲大蠊逐漸受到國內外學者的廣泛關注，其提取物在多種腫瘤中被證實具有較好的抗腫瘤活性[20-22]。如劉童婷等[23]認為PAE可抑制結腸癌HCT 116細胞增殖，具有誘導HCT 116細胞凋亡的作用；楊蕊菲等[24]研究指出，PAE可能通過下調Ras/Raf/ERK1/2信號通路誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡，抑制其增殖。由此可見，PAE可通過抑制腫瘤細胞生長及誘導細胞凋亡等機制來調控腫瘤的惡性進展。鑒于PAE在肺癌臨床治療中的實驗依據還不夠充分，具體的作用機制尚不完全清楚，故本課題組開展了相關研究。本研究的結果與上述研究相符，結果顯示PAE對LUAD HCC-2935細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加逐漸增強，且作用48 h的抑制效應較24 h明顯增強，提示PAE能夠呈時間-劑量依賴性有效抑制LUAD HCC-2935細胞增殖。本研究還發現高濃度(200 mg/L)PAE的細胞增殖抑制率顯著高于40 mg/L順鉑，提示天然中藥美洲大蠊抑制LUAD細胞具有增效減毒的作用，為PAE在腫瘤化療中作為輔助用藥提供了試驗依據。臨床治療中可考慮PAE聯合鉑類藥物治療LUAD，以增加抗腫瘤治療敏感性。

細胞凋亡為一個多基因、多階段和多途徑共同作用的復雜過程，細胞凋亡的異常是導致細胞不能程序性死亡而影響腫瘤惡性進展的重要因素之一[25]。細胞周期調控紊亂亦可導致腫瘤細胞異常增殖[26]。本研究通過流式細胞儀檢測，結果顯示低、中、高濃度的PAE處理LUAD HCC-2935細胞48 h后，其細胞凋亡率逐漸升高，另細胞于G0/G1期和S期所占百分比較對照組明顯降低，而在G2/M期所占百分比較對照組明顯升高，提示PAE呈劑量依賴性誘導LUAD HCC-2935細胞凋亡，且細胞被阻滯于G2/M期。這與王晶[27]報道的PAE可誘導肺癌 H125細胞凋亡，阻滯肺癌H125細胞于S期的結果不相吻合，推測與研究的細胞株及細胞所處的周期不相同有關。

本研究是在體外環境下探討PAE對人LUAD HCC-2935 細胞增殖與凋亡的作用，但機體內存在諸如酶活性、代謝等影響因素，故PAE在體內環境中抑制LUAD細胞增殖的作用機制、細胞凋亡的相關信號通路及分子靶點還有待后續進一步深入研究。