蠟樣芽孢桿菌調控NF-κB信號通路以抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移及侵襲

周倩 饒鳳琴 霍花 齊曉嵐 廖健 洪偉

1貴州醫科大學口腔醫學院∕附屬口腔醫院（貴陽550001）；2貴州醫科大學地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室（貴陽550004）

在每年新增的口腔頜面部腫瘤病例中，有近85%為口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）。作為口腔頜面部中最常見的惡性腫瘤，根據2018年的一項統計數據顯示，全球范圍內口腔惡性腫瘤新增35.5 萬例，死亡人數17.7 萬例［1］。因此，深入研究OSCC 的治療方法迫在眉睫。

人體微生物群落數量龐大，能通過其自身的代謝活動以及對宿主的免疫調節從而參與人體的生理功能［2］。多項研究表明，細菌在癌癥治療中有著巨大潛力，可通過提高機體對腫瘤的免疫應答，從而抑制腫瘤的進程［3-5］。有研究表明，分別向原位腦腫瘤的大鼠、自發性實體瘤的犬以及晚期平滑肌肉瘤的患者注射諾維氏梭狀芽孢桿菌可以有效殺傷癌細胞，并且誘發炎癥反應進一步遏制腫瘤的生長［6］。在接受諾維氏梭狀芽孢桿菌治療的患者中，有42%的患者腫瘤尺寸明顯縮小［7］。NAKATSUJI 等［8］研究表明，分離自健康人類皮膚的表皮葡萄球菌可產生6-HAP 以抑制黑色素瘤的生長。RUBIO 等［9］研究證實，芽孢桿菌的毒素能作用于CDH11 細胞膜受體，從而抑制乳腺癌細胞的活性。此外，芽孢桿菌的代謝產物還能對結腸癌細胞及急性淋巴白血病T 淋巴細胞產生細胞毒性［10］。當芽孢桿菌被巨噬細胞吞噬后，芽孢桿菌產生的蛋白酶InhA1 能剪切NprA 幫助芽孢桿菌從宿主巨噬細胞中逃逸，避免了免疫細胞攻擊［11］。微生物的感染常能引起炎癥的產生［12］。有研究表明，芽孢桿菌感染小鼠后，NF-κB 上游的TLR 受體能夠識別感染并啟動炎癥反應，顯著上調CXCL1、CXCL2 及CXCL10 等炎癥相關基因的表達［13］。芽孢桿菌抑制OSCC 發展的作用機制目前尚未明確。因此，本次實驗采用最常見的蠟樣芽孢桿菌，旨在研究其對OSCC 增殖、遷移及侵襲能力的改變，并探索可能的機制，以期更深入的了解OSCC 與微生物間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞株及菌株人OSCC 細胞SCC-25（四川大學華西口腔醫學院提供），蠟樣芽孢桿菌ZQ-2（貴州醫科大學分子生物學重點實驗室提供），胎牛血清（Gibco，USA），DMEM 培養基（Sigma，USA），青鏈霉素混合液（Gibco，USA），兔抗人P65、pP65、IκBα、pIκBα、IKKγ、GAPDH 單克隆抗體（Abcam，USA），羊抗兔二抗（Absin，CHN），BHI培養基（Solarbio，CHN），CCK-8 試劑盒（Dojindo，CHN），ECL 顯影液（Absin，CHN），BAY 11-7082 抑制劑（Beyotime，CHN）。

1.2 細胞培養SCC-25 細胞培養于含10%胎牛血清，100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 鏈霉素的DMEM培養基中，37 ℃，5% CO2孵育。細胞融合85% ～90%時，0.25%胰酶消化，傳代備用。細胞計數儀計算SCC-25 細胞培養于6 孔板上，密度達到85%～90%時的細胞數量。

1.3 細菌培養蠟樣芽孢桿菌ZQ-23 接種于5 mL BHI 培養基，37 ℃培養18～24 h。稀釋涂布平板法計算細菌數量。菌液離心后棄上清，細菌重懸于無血清無雙抗DMEM 細胞培養基中，調整細菌濃度為1×109CFU∕mL 備用。

1.4 構建細菌感染細胞模型細胞接種于6 孔板培養24 h。根據感染復數（multiplicity of infection，MOI），即蠟樣芽胞桿菌數與SCC-25 細胞數的比值，將MOI 分別為1、50、100 及200 時相應細菌數的蠟樣芽孢桿菌，加入6 孔板與細胞共培養3 h后，更換含雙抗及血清的DMEM 培養基繼續培養0、3、6、9、12、24 h，收集細胞。以上培養條件均為37 ℃，5%CO2。實驗分組為：對照組（SCC-25細胞）、對照+BAY 11-7082 組（SCC-25 細胞+NF-κB 抑制劑）、共培養組（蠟樣芽孢桿菌+SCC-25 細胞共培養）、共培養+BAY 11-7082組（蠟樣芽孢桿菌+SCC-25 細胞共培養+NF-κB 抑制劑）。

1.5 CCK-8 檢測將細胞2.2×103個接種于96 孔板，每孔加培養液100 μL。待細胞貼壁，加入蠟樣芽孢桿菌共培養。每孔加入10 μL CCK-8檢測液，孵育2 h，酶標儀在波長450 mm 處檢測吸光值（OD450）。

1.6 劃痕實驗將細胞接種于6孔板，無血清DMEM培養24 h。每孔使用絲裂霉素0.02 mg∕mL 處理2 h后，加入蠟樣芽胞桿菌培養3 h，用200 μL 槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，加入含雙抗的無血清培養基，于0、24、48、72 h 拍照，計算各時間段細胞遷移率。遷移率=（TX面積-T0面積）∕T0面積。

1.7 Transwell實驗將基質膠與DMEM培養基按1∶8 比例混合加入Transwell 上室，37 ℃凝固2 h。收集感染后的細胞清洗消化重懸，調整細胞數為1×105個∕mL，取100 μL 細胞懸液加入Transwell 上室，下室加入500 μL 培養基放入37 ℃培育24 h，多聚甲醛固定，結晶紫染色后在倒置顯微鏡下隨機選取5 個視野計算細胞數。

1.8 Western blot將收集到的細胞加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，4 ℃12 000 r∕min 離心15 min，取上清，獲得總 蛋 白。BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度。從收集的上清液中提取蛋白質經過高溫煮沸變性，電泳，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗（GAPDH、P65、pP65、pIκBα、IκBα、IKKγ）4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗室溫孵育1 h，ECL 顯影。

1.9 統計學方法應用GraphPad Prism 統計學軟件對數據進行統計分析計量數據采用表示為均數±標準差。兩組間的比較使用t檢驗，多組間的比較使用單因素方差分析檢驗或Kruskal-Wallis 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蠟樣芽孢桿菌抑制細胞增殖選擇MOI 為1、50、100、200 及300 感染細胞后培養24 h，與對照組相比較，MOI 為300 時細胞活性受到抑制（P＜0.001）。檢測各時間點蠟樣芽孢桿菌對SCC-25細胞增殖變化，結果顯示感染后培養48 h 后，共培養組細胞活性明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 蠟樣芽孢桿菌抑制細胞遷移及侵襲采用劃痕實驗于感染后0、24、48、72 h 觀察SCC-25 細胞遷移狀態。隨著時間變化，受感染的SCC-25 細胞遷移率明顯低于同一時間段對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Transwell 侵襲實驗結果表明，共培養組細胞侵襲數低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 蠟樣芽孢桿菌對SCC-25 細胞活性及增殖能力的影響Fig.1 Effect of Bacillus on the activityand proliferation of SCC-25

圖2 蠟樣芽孢桿菌對SCC-25 細胞遷移及侵襲能力的影響Fig.2 The effect of Bacillus on migration andinvasion of SCC-25

2.3 蠟樣芽孢桿菌調控NF-κB 通路相關蛋白的表達Western blot 結果表明，蠟樣芽孢桿菌激活SCC-25 細胞NF-κB 信號通路。當感染后培養時間為12 h 時，隨MOI 升高，P65 及IκBα磷酸化水平上升，IKKγ被活化，差異有統計學意義（P＜0.05）。當MOI = 50，pP65 表達量在感染后培養0 h 達到最大，pIκBα及IKKγ9h 則在9 h 時最高。此外，蠟樣芽孢桿菌感染的SCC-25 細胞經NF-κB 抑制劑BAY 11-7082 處理后，pP65、pIκBα、IKKγ表達受到抑制，NF-κB 通路激活受阻（圖3）。

圖3 蠟樣芽胞桿菌對SCC-25 細胞NF-κB 信號通路的影響Fig.3 Effect of Bacillus on NF-κB signaling pathway of SCC-25

2.4 抑制NF-κB 信號通路后蠟樣芽孢桿菌促SCC-25 細胞增殖、遷移及侵襲能力增強CCK-8實驗結果顯示，共培養組細胞活性明顯低于共培養組+BAY 11-7082，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。劃痕實驗及Transwell 結果表明，經NF-κB抑制劑BAY 11-7082 處理后，受感染的SCC-25 細胞遷移率及侵襲數升高，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

3 討論

目前，在癌癥治療中，利用微生物自身特性及其代謝產物開發新的抗癌手段已成為趨勢。ANTIC等［14］認為來自創傷弧菌的MARTX 蛋白可以通過剪切Ras 蛋白使其失活，從而抑制腫瘤細胞生長。大腸桿菌-CP1 能夠直接作用于前列腺癌病變組織，發揮抑癌特性［15］。芽孢桿菌的毒素制劑還可高效靶向殺滅膀胱癌細胞［16］。本研究選擇SCC-25細胞作為研究對象，首次觀察了蠟樣芽孢桿菌對SCC-25 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討蠟樣芽孢桿菌對炎癥相關NF-κB 通路表達水平的改變情況，以及蠟樣芽孢桿菌調控NF-κB 通路以抑制SCC-25 細胞增殖、遷移及侵襲的機制。

本研究發現，OSCC 細胞SCC-25 感染蠟樣芽孢桿菌后，炎癥相關NF-κB 信號通路中P65 及IκBα發生磷酸化，意味著NF-κB 信號通路活化；加入抑制劑BAY 11-7082 后，以上蛋白磷酸化受到抑制。此外，還檢測到了蠟樣芽孢桿菌對SCC-25 細胞IKKγ表達的影響。有研究發現IKKγ能調節IKK復合體的形成以及信號傳導，促進NF-κB 的活化，從而影響喉鱗癌細胞功能［17］。有學者認為，細胞對蠟樣芽孢桿菌的炎癥反應，可能是由于來自蠟樣芽孢桿菌分泌的溶血性腸毒素和非溶血性腸毒素結合細胞膜受體，在細胞表面形成裂孔，引起K+外流，激活NF-κB下游的NLRP3炎癥小體［18-19］。筆者推測蠟樣芽孢桿菌對SCC25 細胞NF-κB 通路的調控可能也與這兩種腸毒素的分泌有關。

NF-κB 是炎癥中至關重要的轉錄因子，在腫瘤的增殖、遷移及侵襲等進展中起著關鍵作用［20］。本研究證明，蠟樣芽孢桿菌抑制OSCC 細胞SCC-25增殖、遷移及侵襲。加入抑制劑發現，增殖、遷移及侵襲能力明顯增高。這說明，蠟樣芽孢桿菌抑制SCC-25 細胞增殖、遷移及侵襲的機制是通過調控NF-κB 信號達到的。

綜上所述，本研究首次報道了蠟樣芽孢桿菌通過調控NF-κB 信號通路以抑制OSCC 細胞的增殖、遷移及侵襲能力，意味著應用蠟樣芽孢桿菌可能發展成為一種新的OSCC 治療手段，為腫瘤治療提供新的思路。然而，本研究仍缺乏體內實驗以探究蠟樣芽孢桿菌抑制OSCC 的功能，后續本課題組也將進行更深層次的探索。