骨質疏松癥動物模型的構建及實驗方法研究進展*

周靜媛，劉肖珩，沈陽，曾燁，陳宇△，蔣文濤

(1.四川大學生物力學工程省重點實驗室，成都 610065；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，成都 610041)

1 引 言

由于臨床試驗成本高、時間長，動物模型在骨質疏松癥治療藥物的鑒定和選擇中起著至關重要的作用。針對不同類型的骨質疏松，誘導動物產生骨質疏松的方法并不相同，有效的藥物對骨質疏松的治療作用如何體現也需要考慮，因此，構建骨質疏松動物模型的方法及藥物具有治療作用的判斷依據的發展與完善將越來越重要。我們介紹了現有的構建骨質疏松動物模型的方法、給藥實驗的實驗方法及藥物具有治療作用的判斷依據，并為研發治療骨質疏松的新型藥物的選擇提供思路。

2 原發性骨質疏松癥動物模型構建及給藥實驗的實驗方法

原發性骨質疏松是隨著年齡增長必然發生的一種生理退行性病變，可分為絕經后骨質疏松(I型)和老年骨質疏松(II型)。其中絕經后骨質疏松癥是由于機體內雌激素水平下降，成骨細胞和破骨細胞共同維持的骨代謝的動態平衡遭到破壞，導致骨質流失增加，骨微結構破壞，造成骨脆性增加[1]。近年來的研究發現，雌激素具有明顯的抗氧化作用，雌激素的缺乏可能會損害抗氧化系統并導致骨骼中氧化應激水平增加，導致骨吸收增加和骨形成減少，引發骨質疏松[2]。而老年骨質疏松是指隨著年齡增加，人體單位體積骨量低于正常，骨小梁間隙增大，骨基質減少，骨強度降低所造成的骨質疏松。

2.1 絕經后骨質疏松

絕經期雌激素缺乏引起的骨轉換加速是骨質疏松癥最常見的原因，因此，在臨床的治療藥物檢查中，因雌激素缺乏而產生骨質疏松的動物模型是首選。

大鼠骨質疏松動物模型對研究原發性骨質疏松有積極意義，目前廣泛使用的動物模型是Wistar大鼠，周齡大多為12周，要求健康特異性無病原體。廣泛用于動物模型造成絕經后骨質疏松的方法是雙側卵巢切除法(去勢法)[3-6]。

選取大鼠后，對大鼠進行手術并分為假手術組和去卵巢組，分組過程中，應保持每組的大鼠數量相同。假手術組有兩種處理方式：一是麻醉之后只切除一小部分脂肪，而不是雙側卵巢[1]；二是由于采用2%異氟烷麻醉大鼠，假手術組切口縫合而不切除卵巢[5]。去卵巢組又分為模型組和藥物作用組。藥物作用組可根據需要設置高劑量藥物組、中劑量藥物組、低劑量藥物組等，以對藥物作用的最佳用量進行大概估計。設置藥物用量時，應注意基于人體的用量進行轉換，可采用人與大鼠之間的劑量轉換表來得到用量[3]。 治療期過后，對大鼠進行安樂死，取血樣進行生化分析，采集左/右股骨、子宮、陰道，將用于組織學分析的樣品保持在10%中性甲醛中。

2.2 老年骨質疏松

依舊選用大鼠骨質疏松動物模型，可選擇SD(Sprague Dawley)大鼠作為動物模型，不限制動物性別，大鼠此時的骨頭已經發生生理性退化，可采取雙能X射線吸收測定法測定骨密度與骨礦含量，將老年大鼠的測定結果與3月齡大鼠的測定結果進行比較，進一步證實老年大鼠的骨質疏松的發生[7]。

選取大鼠后，需將老年大鼠平均分為模型組與藥物作用組，模型組不做其他處理，藥物作用組可根據需要設置N(N≥1)組，每組作用不同劑量的藥物。

與絕經后骨質疏松不同的是，研究老年骨質疏松，若需要明確骨質疏松造成的影響，則需要設置同等數量的低月齡大鼠(未發生老年骨質疏松)作為模型組的對照組[7]，而研究絕經后骨質疏松的影響，只需要將假手術組與模型組進行對照。另外，以老年骨質疏松為研究對象時，無需進行手術獲得骨質疏松動物模型，但大鼠的月齡應控制在15個月以上，以盡可能再現人類骨質疏松的狀態。此外，需要注意的是，21個月以上的大鼠由于雌激素的缺乏, 雌性大鼠乳腺腫瘤發病率上升, 已不適合用于骨代謝研究。

3 繼發性骨質疏松癥動物模型構建及給藥實驗的實驗方法

繼發性骨質疏松是指由于疾病或藥物等原因所致的骨量減少，骨微結構破壞，骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病，繼發性骨質疏松癥的病因有很多，包括藥物治療、甲狀腺功能亢進、維生素D缺乏、原發性甲狀旁腺功能亢進等。

糖皮質激素性骨質疏松癥(GC-induced osteoporosis，GIO)是繼發性骨質疏松癥的常見形式，是導致發病率和死亡率增加的一個原因[8]。糖皮質激素(Glucocorticoids，GCs)是治療炎癥性和風濕性疾病的廣泛藥物。 然而，GCs可通過抑制成骨細胞的增殖和分化，增加骨脆性和骨折的概率[9]，導致繼發性骨質疏松甚至骨壞死。據估計，30%～50%的接受長期GCs治療的患者會發生糖皮質激素誘發的骨質疏松[10]。

大鼠糖皮質激素性動物模型對研究人類糖皮質激素引起的繼發性骨質疏松有積極意義，目前廣泛使用的動物模型是SD大鼠和Wistar大鼠，周齡大多為8周[11]或12周[9-10]，目前廣泛用于動物模型上誘導糖皮質激素誘發的骨質疏松的藥物是地塞米松[9-11]，該藥物是一種人工合成的強效、長效糖皮質激素，具有抗炎、抗過敏、抗休克作用，易獲得且價格便宜。

大鼠糖皮質激素性動物模型建立之后，設置樣本對照組、模型組和藥物作用組，藥物作用組的動物已被地塞米松誘導，患有骨質疏松GIO，每組大鼠數量相同，藥物用量不同，設置多組實驗組，避免實驗偶然性，同時，有望通過多個實驗組，找出治療GIO的藥物的最佳用量[12]。某些藥物被提取出來之后是以結晶粉末的形式存在，給藥時，需要根據其溶解性溶于助溶劑中[13]。處死大鼠后，取其股骨和血清作進一步評估。

4 藥物具有治療作用的判斷依據

對于不同類型的骨質疏松，實驗分組見圖1。

圖1 各類骨質疏松動物實驗的實驗分組Fig.1 Experimental group of animal experiments on osteoporosis

以大鼠為模型研究不同類型的骨質疏松時，動物實驗的分組可分為空白對照組、模型組與藥物作用組。圖1中假手術組、低月齡組、樣本對照組均屬于空白對照組，由于股骨是最容易骨折的部位[13],在骨質疏松動物模型中，大都以股骨為研究對象來測定骨密度、骨礦含量等，在進行試驗時，測得各類指標之后，模型組與空白對照組對照，得出患有骨質疏松對各類指標的影響，藥物作用組與模型組對照，得出藥物治療后，骨質疏松的改善情況。

藥物是否具有治療作用需要客觀的指標來判斷。現有的判斷指標主要有骨量變化、骨組織形態計量學測定、血樣生化參數、骨生物力學指標檢測等。其中，骨量變化和骨組織顯微結構變化與骨生物力學性能是主要指標，各類指標見表1。

表1 藥效判斷指標Table 1 Pharmacodynamic index

值得注意的是，在對血清中的鈣、磷進行檢測時，鈣、磷水平變化不明顯[3]，因此，該項指標應作為輔助指標。對絕經后骨質疏松而言，由于該類型骨質疏松的發病與雌激素的減少有關，在比較各項指標時，可增加對雌二醇的檢測[1，3]，若藥物能提高動物體內的雌二醇水平，可進一步評定藥物有效，另外，可以計算出大鼠子宮、陰道等的器官系數，器官系數提高，表明藥物對子宮和陰道組織有保護作用，器官系數計算公式如下[3]：

(1)

(2)

最后，相比老年骨質疏松而言，絕經后骨質疏松是高轉換型骨質疏松，經過藥物治療后，骨鈣素水平會降低得更為明顯，因此，骨鈣素是絕經后骨質疏松的藥物研究中的一個重要指標，在老年骨質疏松中重要程度較低。以上指標均能從不同方面反映骨質疏松的治療情況，需要對多種指標進行全面分析，才能得到關于藥物治療效果的全面判斷。

5 改進骨質疏松治療方案的實驗方法

骨質疏松癥的特征是低骨量、易骨折。由于骨質疏松癥涉及到骨形成減少和骨吸收增加，很明顯可以通過聯合抗吸收和骨合成的藥物來治療骨質疏松癥；另外，某些治療骨質疏松合成代謝藥物存在治療窗口不長，患者對注射這些藥物的依從性較差，患者有針頭恐懼癥等問題，這種情況下，可從給藥方式進行優化，如將皮下注射改為鼻腔給藥等。

因此，研究聯合藥物進行治療和改變給藥方式對研究骨質疏松具有重要意義。

5.1 聯合藥物進行治療

對于聯合藥物的研究，大鼠糖皮質激素性動物模型建立之后，對大鼠進行分組，注意每組大鼠數量應該相同。實驗分組見圖1，就藥物作用組而言，設置靜脈注射兩種藥物聯合組，單獨抗吸收藥物組，單獨骨合成藥物組，并注意聯合作用藥物組的藥物用量可根據劑量反應的研究成果來確定[15]或設置為單獨藥物作用時的含量的疊加[7]。在治療結束時，采集大鼠血清和股骨，對表1中各類指標進行檢測，若聯合藥物的療效好于單獨的藥物作用情況，證實聯合藥物具有一定的可行性。

5.2 改變給藥方式

選取健康SD大鼠，設置鼻腔給藥組、皮下注射組，評價鼻腔噴霧劑治療骨質疏松的潛力，鼻腔噴霧劑有效性的關鍵因素是藥代動力學，若結果顯示鼻腔噴霧劑在大鼠模型中具有與皮下注射等效的藥代動力學曲線，峰值血藥濃度相當，證明該藥物可由鼻腔給藥[16]。

6 治療骨質疏松的新型藥物的選擇方向

綜合原發性骨質疏松與繼發性骨質疏松的發病機制進行考慮，研發新藥時，可從以下幾個方面進行選擇：

(1)對原發性骨質疏松而言，由于雌激素減少導致容易氧化，可選擇具有抗氧化性能的物質[1，6]；

(2)具有促進成骨細胞分化提高成骨作用的物質[9]和抑制破骨細胞骨吸收的物質[17]都可作為備選研發藥物；

(3)從治療其他疾病的藥物中進行選擇[17-18]；

(4)根據以往的研究，在統計上去除體重的機械負荷效應后，體脂質量與骨量呈負相關，提示可以通過減重來增加骨量，從而預防骨質疏松[1]；

7 總結

綜上所述, 根據研究目的的不同，需采取不同的方法建立骨質疏松動物模型，這對于骨質疏松的發病機理的研究、新藥研究、藥物的改進均十分關鍵。目前，雙側卵巢切除法獲得原發性骨質疏松動物模型和激素誘導獲得繼發性骨質疏松動物模型是兩種常用方法。

總體來說，有效藥物應能改善血液生化指標，提高骨密度、骨礦含量及骨力學性能等。比較各類指標，確認藥物有效之后，也應考慮藥物在治療骨質疏松時的副作用、最佳用量、是否可以通過改變給藥方式或與其他藥物的聯合治療來增強療效等問題。考慮繼發性骨質疏松的病因，今后的研究中，需要克服的問題還有如何控制會引起骨質疏松的藥物(如糖皮質激素等)的用量，使其既能有效治療病癥，又不會引起繼發性骨質疏松。隨著新技術的發展和骨質疏松研究的不斷深入,相信建立骨質疏松動物模型、藥物研發及提升藥物療效的方法將會越來越完善。

致謝

感謝國家自然科學基金重點項目“骨質疏松骨鈣流失與血管壁鈣鹽沉積：基質囊泡介導鈣轉移的力學生物學機制(11932014)”的支持。