纖維素分解菌與布氏乳桿菌聯合接種對青貯玉米發酵品質、有氧穩定性和瘤胃降解參數的影響

張凡凡 張玉琳 王旭哲 賈舒安,2 馬春暉*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子832000；2.新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，烏魯木齊830011)

青貯玉米是世界范圍內最為重要的反芻家畜飼料原料之一，而其發酵過程受制影響因素諸多，如何控制發酵體系厭氧條件、含水量、能氮平衡、產酸能力等，以達到提質降耗的目的是青貯加工研究的重點問題[1]。一直以來，添加微生物制劑是國內外學者改善青貯品質的主要手段[2-4]。乳酸菌制劑常被應用于各類青貯飼料中，其作為一種發酵促進劑，主要作用是調節青貯原料微生物區系，以確保青貯營養成分的保存；同時促進多糖和纖維的轉化，提高青貯的消化率及適口性[1]。根據乳酸菌代謝產物的不同將其分為同質型和異質型乳酸菌[2-3]。其中，接種乳酸桿菌(Lactobacillusspp.)或片球菌(Pediococcusspp.)等的同質型乳酸菌可利用葡萄糖產生乳酸，確保發酵體系前期快速達到酸性環境，以減少蛋白質的降解和乙醇的生成；同時可顯著提高干物質回收率和剩余可溶性碳水化合物含量，進而改善青貯品質[4]。然而同質型乳酸菌產生的揮發性脂肪酸(乙酸、丙酸)含量極少，不能有效抑制青貯中致腐真菌等的生長，不僅增加了干物質的損失，且造成青貯的二次發酵，降低有氧穩定性(aerobic stability，AS)，并對家畜健康造成潛在威脅[5-7]。類如布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)或腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等的異質型乳酸菌雖消耗青貯底物營養物質較多，且乳酸轉化效率低，但其利用葡萄糖和乳酸源產生的乙酸能夠有效抑制霉菌的生長，且可通過提高青貯的有氧穩定性以彌補潛在的營養損失[6-8]。因此，諸多研究采用同質型、異質型乳酸菌聯合接種以改善青貯品質[2-3]；但即便聯合接種，異質型乳酸菌在發酵體系中仍占據主要地位；眾多研究也證實了采用同質型乳酸菌∶異質型乳酸菌=1∶4的比例進行聯合接種效果更優[2]。隨著目前飼料業的飛速發展，單純乳酸菌制劑依然不能滿足現有行業的需求，因此諸多學者將乳酸菌制劑與纖維素酶、半纖維素酶等酶制劑進行配合使用，其主要目的是通過纖維類物質向單糖的轉化，促進乳酸菌發酵，提高飼料利用率及動物生產性能[9-10]。那么，利用某些纖維素分解菌(cellulose decomposing bacteria，CDB)產酶特性是否能達到相同的目的？黑曲霉(Aspergillusniger)、綠色木霉(Trichodermaviride)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為美國食品藥品監督管理局(FDA)和我國農業部認證的安全菌，均能產生高活性的纖維素酶、酸性蛋白酶、果膠酶等多種胞外酶，適合飼用復合酶的固體生產[11]。這3種產酶菌均為好氧菌，理論上在青貯發酵早期大量繁殖，產生大量分解底物的酶類物質，迅速消耗原料中的氧氣，使青貯飼料進入無氧狀態，其活動還可以提高青貯體系溫度，從而抑制其他好氧腐敗菌的生長繁殖。此外，某些纖維素分解菌對青貯品質和奶牛消化率的提升作用也均已得到證實[12-13]。而這些產酶細菌與異質性乳酸菌的協同效果如何？是否能夠改善青貯品質？目前尚未明確。鑒于此，本研究擬將Aspergillusniger、Trichodermaviride、Bacillussubtilis與Lactobacillusbuchneri聯合接種發酵青貯玉米，通過對青貯玉米發酵品質、微生物含量、有氧穩定性、瘤胃降解率等的詳細分析，明確二者之間協同作用對青貯發酵的影響，為我國今后新型青貯菌劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯玉米試驗地位于新疆石河子大學牧草試驗站(N44°20′，E88°30′，海拔420 m)，當地為典型的大陸性干旱氣候，年日照時間2 721～2 818 h，年降水量180～270 mm，年蒸發量1 000～1 500 mm，年平均溫度7.5～8.2 ℃，無霜期147～191 d。耕作土層(0～30 cm)有機質含量16.7 g/kg，堿解氮含量17.3 g/kg，速效磷含量0.64 g/kg，pH為6.44。青貯玉米種植時間為2017年4月10日至2017年8月20日(生長期為112 d)，玉米種植為穴播，密度按照寬窄行處理(60 cm+40 cm)，種植面積為1 050 m2，灌水方式采用滴灌，按照一般青貯玉米種植管理模式進行管理。在青貯玉米進入乳熟末期蠟熟初期(玉米乳線超過2/3)時進行全株刈割，當場粉碎至2 cm左右長度，待貯。

BacillussubtilisACCC19374、AspergillusnigerACCC 30134和TrichodermavirideACCC 30595，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，LactobacillusbuchneriCICC 20293購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2 試驗設計

全株玉米粉碎后立刻采用真空袋法調制青貯(同時留取發酵初始樣品進行各指標分析)。試驗設3個處理，CK處理(對照處理)不添加任何菌種；Y處理添加4.7×105CFU/gLactobacillusbuchneri；YX處理添加4.7×105CFU/gLactobacillusbuchneri和纖維素分解菌，纖維素分解菌添加比例為Aspergillusniger∶Trichodermaviride∶Bacillussubtilis=2∶1∶1(質量比)，添加量為0.3%，添加比例和添加量均已在實驗室理論情況下進行初步驗證[11]。將各菌種分別在MRS(培養Lactobacillusbuchneri)、NB(培養Bacillussubtilis)、PDA(培養Aspergillusniger、Trichodermaviride)液體培養基中培養，平板計數后確定其數量，按比例配制菌液，以鮮重為基礎進行添加。各處理分別混合均勻后稱取約2.0 kg樣品于聚乙烯厭氧袋中真空密封(真空袋規格40 cm×50 cm)，實驗室環境(23～30 ℃)下發酵60 d，每個處理6個重復，共計調制18袋。第60天時全部模擬開窖(厭氧袋開袋)，測定相關指標(測定3個重復)。

1.3 測定指標及方法

發酵特性主要測定pH、可溶性碳水化合物(WSC)、有機酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)和氨態氮(NH3-N)含量。其中，pH用酸度計(PHSJ3F酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司)測定，WSC含量采用蒽酮比色法(722可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司)測定，有機酸含量采用液相色譜法(Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司)測定，氨態氮(NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸比色法[14-15]測定。

營養物質指標主要測定干物質(DM)、粗蛋白質(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、淀粉(Starch)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。其中，DM含量采用烘干法(精密型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海合恒儀器設備有限公司)測定，CP含量采用凱氏定氮法(Kjeltec 8400 FOSS全自動凱氏定氮儀，美國福斯公司)測定，EE含量參照索氏浸提法(玻璃索氏提取器)測定，Ash含量參照采用灰化法(XL-3000型高效節能智能一體馬弗爐，上海合恒儀器設備有限公司)測定[15]，Starch含量參照酶水解法測定[16]，NDF和ADF含量采用ANKOM A200i全自動纖維分析儀(美國安康公司)測定。

微生物主要測定乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、酵母菌、好氧細菌(aerobic bacteria，AB)和霉菌數量。好氧細菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌分別采用MRS培養基、麥芽糖浸粉瓊脂培養基、營養瓊脂培養基和高鹽察氏培養基進行培養(培養基均采購自北京路橋集團有限公司)，培養結束后進行平板計數，并計算微生物數量[17]。

有氧穩定性主要測定樣品60 d開袋后的溫度變化(設定每5 min間隔記錄1次)，將多點式溫度記錄儀(i500-E3TW，玉環智拓儀器科技有限公司)的多個探頭分別放置于發酵袋中心，每個處理放置3個溫度探頭，同時在實驗室中放置3個探頭測定環境溫度。當樣品溫度高于環境溫度2 ℃時記錄時間即為有氧穩定性時間[5]。二氧化碳(CO2)濃度測定按文獻描述[5,7,18]，自制CO2產氣裝置。所有產氣裝置置于30 ℃的恒溫培養箱中進行測定。

選用3只體況良好、體重(50.0±2.00) kg、安裝永久性瘤胃瘺管的哈薩克羊。試驗飼糧由200 g精料(精料組成：玉米51.0%、麩皮24.0%、豆粕18.0%、碳酸氫鈣2.5%、添加劑2.0%、尿素1.5%、食鹽1.0%，天康畜牧生物技術公司提供)和1.8 kg青貯玉米組成，于晨飼前(08:00)進行投放，全天自由飲水。參照瘤胃瘺管尼龍袋法[19]測定青貯玉米在瘤胃中12、24、36、48、72 h的DM、NDF、ADF、有機物(OM)含量，將前期測定營養品質指標的烘干樣品復烘(65 ℃)至恒定過篩(40目)，裝在尼龍袋中，尼龍袋尺寸為6 cm×9 cm，孔徑40～50 μm，每袋準確填裝3 g樣品，填裝后用尼龍線扎口綁在鐵鏈上投放至瘤胃中，每個樣品每個時間點每頭羊設置4個重復，共計180袋，分2次進行投放，各處理樣品隨機放置于3只羊瘤胃中，每次每只羊30個。到相應時間后將尼龍袋取出沖洗干凈，在65 ℃烘箱中烘干48 h，測定各營養成分含量。瘤胃降解率和降解特征參數計算方法如下[20-21]：

Dx=[(MA-MB)/MA]×100；
Dp=a+b(1-e-ct)×100；
ED=a+[(b×c)/(k+c)]×100。

式中：Dx為待測樣品某成分的瘤胃降解率(%)；MA為待測樣品消化前某成分含量(g)；MB為待測樣品消化后某成分含量(g)；Dp為t時刻被測樣品中某成分的實時瘤胃降解效率(%)；t為飼料在瘤胃內停留的時間(h)；a為快速降解部分(%)；b為慢速降解部分(%)；c為慢速降解部分的降解速率(%/h)；ED為某成分在瘤胃內的有效降解率(%)；k為被測樣品中某成分瘤胃外流速率常數(%/h)，取1.8%/h。采用Matlab軟件進行偏最小二乘計算，求得各相關參數。

1.4 數據分析

試驗數據使用Excel 2016軟件整理，采用SPSS 22.0統計軟件進行F檢驗，F檢驗之后進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用Duncan氏法。采用Origin 2017軟件進行繪圖。采用模糊相似優先比法評價最優處理[22]，運用DPS V7.05軟件將樣品10項指標進行分析計算(由于本研究各處理對某些重要指標無顯著影響，因此僅選擇存在顯著差異的指標進行評價)，對其設定識別標識為1；固定樣本即為參考品種(各指標為理論最優)，對其設定識別標識為0，執行“模糊相似優先比分析”功能，計算結果中待測樣與參考品種的相似程度大小即反映牧草品質的優劣。

2 結果與分析

2.1 不同處理對青貯玉米發酵品質及微生物數量的影響

由表1可知，各處理pH、WSC、DM、淀粉、NDF、ADF含量及4類主要微生物(好氧細菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌)數量均較初始發酵時明顯下降，乳酸、乙酸、NH3-N、EE含量較初始發酵時明顯上升，CP和Ash含量變化不明顯。其中，Y處理pH顯著低于CK和YX處理(P<0.05)，CK處理WSC含量顯著高于Y和YX處理(P<0.05)，YX處理乳酸含量顯著高于CK和Y處理(P<0.05)，YX處理乙酸含量顯著高于CK處理(P<0.05)，各處理丙酸和丁酸含量均未檢測出，Y處理DM含量顯著高于CK處理(P<0.05)，YX處理NDF含量顯著低于CK和Y處理(P<0.05)，YX處理EE含量顯著高于CK和Y處理(P<0.05)。各處理間NH3-N、淀粉、CP、ADF、Ash含量及4類主要微生物數量差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 不同處理對青貯玉米開袋第5天時有氧穩定性及微生物數量的影響

由表2可知，青貯玉米開袋第5天時，YX處理pH和霉菌數量均顯著高于Y和CK處理(P<0.05)，CK處理CO2濃度顯著高于Y和YX處理(P<0.05)，YX和Y處理有氧穩定性顯著高于CK處理(P<0.05)。各處理間好氧細菌、乳酸菌、酵母菌數量差異均不顯著(P>0.05)。

表2 不同處理對青貯玉米開袋第5天時有氧穩定性及微生物數量的影響

2.4 不同處理對青貯玉米瘤胃營養物質降解率及降解參數的影響

由圖1可知，隨瘤胃停留時間的延長，各營養物質在瘤胃中的降解率呈上升趨勢。其中，DM降解率僅在48 h時，CK處理顯著高于Y處理(P<0.05)；NDF降解率僅在36 h時，Y處理顯著高于CK處理(P<0.05)；OM降解率僅在72 h時，CK和Y處理顯著高于YX處理(P<0.05)。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，DM降解參數中，Y處理的DM基礎含量顯著高于CK處理(P<0.05)，CK處理的DM有效降解率顯著高于YX處理(P<0.05)。NDF降解參數中，YX處理的NDF基礎含量顯著低于Y和CK處理(P<0.001)，YX處理的NDF慢速降解部分的降解速率顯著高于Y處理(P<0.05)。各處理間其余各指標降解參數差異均不顯著(P>0.05)。

表3 不同處理對青貯玉米瘤胃降解參數的影響

2.5 不同處理復合發酵青貯玉米綜合價值評價

采用模糊相似優先比分析，10個指標權重選取均設定見表4，求得不同處理與參考樣本(表4)間各指標的相似序號之和，相似度越小，該處理與參考理想樣本的綜合價值越接近，綜合價值越好，結果表明(表5)，YX處理(1.80)>Y處理(1.95)>CK處理(2.25)。

表4 參考品種綜合品質及其權重

表5 各處理與參考品種相似程度及綜合價值排序

3 討 論

3.1 纖維素分解菌與Lactobacillus buchneri復合發酵對青貯玉米發酵品質及微生物數量的影響

青貯飼料的發酵品質是由多個指標所共同決定的。飼料pH的增加是檢驗青貯飼料是否變質的直觀參數[23]，NH3-N和有機酸含量則反映青貯飼料中蛋白質和碳水化合物轉化情況。其中，青貯過程中多種微生物對底物蛋白物質的大量消耗，轉化成NH3-N和胺類物質；且pH在3～7時，隨著pH的增大，蛋白質水解作用增強[1]，本研究雖各處理pH存在差異，但均未顯著影響蛋白質的腐敗，即各處理間CP、NH3-N含量差異不顯著，而各處理NH3-N含量較發酵前有所升高，其原因可能由于梭菌未被完全抑制，導致蛋白質分解所致[4]；此外，由于發酵結束時未檢測到丙酸與丁酸，更有可能的原因則是由于纖維素分解菌中Aspergillusniger提高了NH3-N含量[24]，具體原因還有待進一步探索。以往研究在青貯玉米中單獨添加Lactobacillusbuchneri或與纖維素酶聯合接種均可降低青貯pH，提高乳酸、乙酸含量[8-10,25]。本研究Lactobacillusbuchneri與纖維素分解菌聯合接種時，乳酸和乙酸含量均最高，說明纖維素分解菌的接種并未抑制青貯中乳酸菌的產酸能力，這與前期培養基中理論情況結論相同[11]；而聯合接種使得發酵體系整體pH變高，且開袋第5天時也表現相同結果，這說明接種纖維素分解菌可能降低了青貯抵御外來好氧微生物的能力，進而使得pH有略微升高；另一種可能是由于聯合接種產生了競爭性抑制，進而一定程度上促進了同質性乳酸菌利用底物產乳酸的能力，具體原因還有待繼續探索。但總體聯合接種Lactobacillusbuchneri與纖維素分解菌有利于發酵體系產酸，維持較為適中的酸度。

以往研究表明，纖維素酶和乳酸菌制劑聯合接種使用可有效減少青貯玉米NDF和ADF含量[9-10,26]。也有研究將纖維素酶、果膠酶與Lactobacillusbuchneri聯合接種玉米秸稈后發現，NDF、ADF、纖維素及半纖維素含量顯著降低，玉米秸稈營養品質得到改善[27]。本研究得到相同結果，其原因主要由于纖維素分解菌產胞外酶作用所致，這一結果證明了纖維素分解菌和Lactobacillusbuchneri復合接種，纖維素分解菌能夠起到降解纖維的作用。本試驗中，各處理DM含量較青貯前有所下降，而其中接種Lactobacillusbuchneri較不添加菌劑處理可顯著提高DM含量，其原因可能是Lactobacillusbuchneri可啟動發酵后期由異質型乳酸菌主導的異質型發酵，加速了青貯內乙酸等揮發性脂肪酸的生成，抑制有害微生物的活動，從而降低有害微生物對DM的損耗[2-3,6-8]。另外，本研究中各處理淀粉和WSC含量均較青貯前下降，其主要原因為青貯體系微生物對底物糖類物質的利用所致[1]。本研究中的2個接種處理均顯著降低了WSC含量，一定程度上促進了乳酸、乙酸的生成；然而，各處理間淀粉含量無顯著差異，其原因可能為纖維素分解菌中Bacillussubtilis產生的α-淀粉酶含量過低所致[28]。本研究中EE含量較發酵前有所升高，其與以往研究結果[29]相似，可能的原因主要由于水分的損失，造成混貯底物總質量下降；而復合接種較其他處理顯著提高了發酵體系EE含量，其原因可能由于纖維素分解菌的作用抑制了脂肪類物質的腐敗[24]。除此以外，發酵60 d時主要微生物數量較發酵前下降明顯，而各處理之間并未產生顯著差異，其原因主要是在青貯發酵的過程中，底物營養物質的消耗使得好氧細菌、乳酸菌發酵前期數量增加而發酵后期數量減少，直至趨于穩定；酵母菌和霉菌生長繁殖受到抑制，主要受發酵體系厭氧環境和酸性環境影響[1]。

3.2 纖維素分解菌與Lactobacillus buchneri復合發酵對青貯玉米有氧穩定性的影響

有氧穩定性是指青貯飼料在開封后隨著pH、溫度升高依然保持新鮮、氣味酸香的能力。一般實際生產中青貯玉米開袋后接觸到空氣的部分不會超過5 d[6-8,30]。因此，本研究以有氧暴露第5天的各項指標分析不同處理對青貯玉米有氧穩定性的影響，結果表明Lactobacillusbuchneri單獨或與纖維素分解菌聯合接種均可顯著降低CO2產氣量，其主要原因由于異質型乳酸菌利用底物生成乙酸，抑制好氧微生物的生長[5]。同時，諸多研究表明，Lactobacillusbuchneri能夠改善青貯飼料有氧穩定性[8]，本研究也得到相同結論，Lactobacillusbuchneri無論單獨或聯合纖維素分解菌接種，均可使有氧穩定時間持續在190 h以上，顯著高于不接種處理。霉菌、好氧細菌和酵母菌一直以來被認為是導致青貯飼料有氧變質的主要微生物。本研究中，接種纖維素分解菌的處理使得霉菌數量顯著高于其他處理，原因主要由于纖維素分解菌中Aspergillusniger和Trichodermaviride增加了發酵體系霉菌數量；然而各處理間好氧細菌、乳酸菌和酵母菌數量并未產生顯著差異，其原因主要由于開袋后發酵體系變成有氧環境，青貯底物接觸到更多好氧微生物，不僅為其提供了繁殖所需要的營養物質，且pH的升高為好氧微生物創造了更有利的環境[5]，因而在開袋有氧環境下各類菌劑未能顯著影響微生物生長。另外，由于本研究采用真空袋法青貯，由于發酵體系較小(2 kg)，接種的菌劑在有氧環境下發揮作用不明顯，因此還需今后擴大發酵體系進行更為貼近生產的研究。

3.3 纖維素分解菌與Lactobacillus buchneri復合發酵對青貯玉米瘤胃降解率的影響及綜合評價

微生物發酵可改變飼草原料細胞壁的微觀結構，破解纖維素之間的碳鏈，使纖維結構疏松，有利于瘤胃微生物附著并產生消化酶，促進纖維成分快速降解，同時也有利于被木質化成分包被的營養成分釋放，提高營養物質的瘤胃降解率[1,19,31]。諸多研究證實，青貯玉米在瘤胃中各營養物質的有效降解率主要取決于瘤胃消化時間，尤其是纖維性物質在瘤胃消化需要保證有效的消化時間[32]。在本試驗中，DM、ADF、NDF、OM降解率隨瘤胃停留時間的延長(12～72 h)逐漸升高，這與以往研究結果相同。瘤胃內環境作為一個相對復雜的微生物系統，其中多種微生物發揮著重要作用[19]，而本研究接種各菌劑處理并未顯著影響ADF、NDF和OM有效降解率，其原因可能由于接種的菌劑主要在發酵過程中起作用，僅改變了青貯的發酵品質和營養價值等，對瘤胃微生物區系的影響甚小。其中，Lactobacillusbuchneri和纖維素分解菌聯合接種顯著降低了DM有效降解率，其原因可能是二者的協同性作用限制了反芻家畜對DM的實際利用效率，具體還需要繼續對協同效應進行深入研究。

目前，對于青貯質量的綜合評價往往單純以發酵指標、飼用指標等進行評價；或采用V-Score、隸屬函數法進行綜合評價[5,22,33]。采用這些評價方法評價較為片面且未考慮權重因素，因此本研究通過經驗和文獻法設定主要指標(各處理間產生顯著變化的指標)權重，采用相似優先比分析，通過對標參考樣本(理論設定各指標均為最優)進行綜合評價，評價出的結果更具有全面性，以此得到最優處理為Lactobacillusbuchneri和纖維素分解菌聯合接種綜合效果最優，然而由于目前尚無青貯有氧穩定性和瘤胃降解率的相關國標，且在指標選取中，選擇的指標不同造成了權重的不確定性，因此今后還需繼續深入研究，明確各指標在青貯中的重要程度，以此作出更為科學的評價。

4 結 論

青貯玉米中Lactobacillusbuchneri單獨或與纖維素分解菌群聯合接種可有效改善青貯玉米的發酵品質，提高青貯的有氧穩定性。綜合評價表明，纖維素分解菌和Lactobacillusbuchneri聯合接種效果最好。