楊木屑酶解液作為碳源制備細(xì)菌纖維素的條件優(yōu)化

（山東恒誠檢測科技有限公司 山東 250000）

1.材料與方法

(1)菌株

木醋桿菌。菌株。山東省微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

(2)主要試劑

葡萄糖（北京陸橋），蛋白胨（北京陸橋），酵母粉（北京陸橋），無水磷酸氫二鈉（國藥集團(tuán)，檸檬酸一水化合物（國藥集團(tuán)）。

(3)主要儀器

天平、高壓蒸汽滅菌器、生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱。

(4)培養(yǎng)基

楊木屑酶解液的預(yù)處理：將楊木屑與蒸餾水按1:20混合加入，調(diào)節(jié)pH為6，加入纖維素酶液和半纖維素酶液，混合均勻，50℃水浴條件下加熱的時(shí)間5h。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5g，無水磷酸氫二鈉0.5g，檸檬酸一水化合物0.5g。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，楊木屑酶解液100（ml/L），蛋白胨5g，酵母粉5g，無水磷酸氫二鈉2.4g，檸檬酸一水化合物1.0g，pH6。

(5)產(chǎn)量的測定

用鑷子取出靜置培養(yǎng)數(shù)天后培養(yǎng)基表面形成的細(xì)菌纖維素，在蒸餾水中小心沖洗數(shù)次，直到細(xì)菌纖維素表面的菌落和培養(yǎng)基洗凈，然后將洗干凈的細(xì)菌纖維素濕膜放入含有0.1mol/L的NaOH溶液的燒杯中，在90℃條件下水浴加熱2h。然后取出細(xì)菌纖維素濕膜繼續(xù)用蒸餾水沖洗數(shù)次，至中性。最后用分析天平稱重。

(6)單因素法優(yōu)化產(chǎn)酶條件

①不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

將種子液不同接種量分別接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，然后測定細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，篩選出最佳接種量。

②不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基（其他成分同基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基），其他條件保持不變。

③不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在上述優(yōu)化條件下，將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基上，其他條件保持不變。

④培養(yǎng)基的不同初始pH對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的無水磷酸氫二鈉和檸檬酸一水化合物培養(yǎng)基（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉采用最佳濃度，其他成分同基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基），并調(diào)節(jié)至不同的初始pH，其他條件保持不變。

⑤發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分，在不同的溫度下靜置培養(yǎng)，其他條件保持不變。

⑥發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分，在最佳發(fā)酵溫度下靜置培養(yǎng)不同的時(shí)間，然后測定細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

(1)不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在上述條件下，接種量按照體積比分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%進(jìn)行接種，結(jié)果見圖1，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著接種量的增加不斷升高，當(dāng)接種量達(dá)到5%時(shí)，產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，因此選用5%作為最佳接種量。

圖1 不同接種量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

(2)不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在最佳接種量的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著葡萄糖濃度的增加先增加后下降，當(dāng)濃度在15g/L時(shí)，產(chǎn)量最高，因此選用15g/L作為最佳葡萄糖濃度。

圖2 不同濃度葡萄糖對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

(3)不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在最佳接種量、最佳葡萄糖濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖3，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著蛋白胨濃度的增加先增加后下降，當(dāng)濃度在7.5g/L時(shí)，產(chǎn)量最高。

細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著酵母粉濃度的增加先增加后下降，當(dāng)濃度在7.5g/L時(shí)，產(chǎn)量最高，因此選用7.5g/L作為最佳酵母粉濃度。

圖3 不同濃度蛋白胨和酵母粉對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

(4)培養(yǎng)基的不同初始pH對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖4 不同初始發(fā)酵pH對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

在最佳接種量、最佳葡萄糖、蛋白胨、酵母粉濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖4，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著初始pH的增加先增加后下降，當(dāng)pH為5.5時(shí)，產(chǎn)量最高，因此選用無水磷酸氫二鈉2.1g，檸檬酸一水化合物1.2g，調(diào)節(jié)pH至5.5作為最佳初始發(fā)酵pH。

(5)發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)量的影響

選用最佳培養(yǎng)基成分，在不同的溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）下靜置培養(yǎng)6d進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖5，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的增加先增加后急劇下降，發(fā)酵溫度30℃時(shí)，仍然產(chǎn)量最高，因此30℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

3.結(jié)論

到目前為止，細(xì)菌纖維素的合成產(chǎn)量一直受各種因素的影響，而優(yōu)化其發(fā)酵條件是目前主要的研究方向，這對于中式生產(chǎn)或工業(yè)生產(chǎn)具有重要的借鑒意義。

本文通過單因素法，對一株木醋桿菌利用楊木屑合成細(xì)菌纖維素的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g，酵母粉7.5g，無水磷酸氫二鈉2.2g，檸檬酸一水化合物1.2g，pH5.5，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間5d的發(fā)酵條件，其產(chǎn)量較優(yōu)化前調(diào)高了近1倍。