慢性HBV相關肝病患者HBV基因型和耐藥突變位點與疾病進展的關系

劉理冠 葉巧霞 嚴彥 顏燕燕 黃志杰 張小曼

核苷(酸)類似物(NAs)因抑制病毒復制能力強、使用方便和不良反應小等已成為我國治療乙型肝炎的主要藥物，主要包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)、阿德福韋酯(ADV) 和替諾福韋酯(TDF)[1]。但其也存在缺點，如停藥困難，患者須長期使用，部分患者出現了NAs耐藥，導致治療失敗[2]。究其原因發現與患者HBV反轉錄酶區(reverse transcriptase,RT)產生耐藥突變有關，HBV-RT耐藥突變可使機體發生病毒學和生化學突破，是慢性HBV相關肝病進展的重要原因[3-5]。此外，耐藥突變可能與HBV基因型亦存在一定關聯[6]。本研究探討慢性HBV相關肝病患者HBV基因型和耐藥突變位點與疾病進展的關系。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2019年12月于解放軍聯勤保障部隊第九一〇醫院診療的慢性HBV相關肝病患者230例，其中男150例，女80例；年齡為18～79歲。慢性乙型肝炎患者175例，乙型肝炎相關肝硬化患者40例，乙型肝炎相關肝癌患者15例。納入標準：①診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和《原發性肝癌診療規范》[8]；②使用NAs治療超過24周；③知情且簽署知情同意書；排除：①合并甲、丙、丁及戊型肝炎病毒共同感染者；②合并酒精性肝病和或自身免疫性肝病。慢性乙型肝炎患者中，男120例，女55例；年齡為(54.8±11.3)歲；乙型肝炎相關肝硬化患者中，男29例，女11例；年齡為(55.0±11.2)歲；乙型肝炎相關肝癌患者中：男12例，女3例；年齡為(54.1±10.9)歲；3組患者的性別和年齡比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。

二、方法

(一)標本收集 抽取空腹靜脈血，分離血清，儲存于-80℃冰箱待用。

(二)HBV RT區測序 采用ABI 3500XL型基因測序儀檢測血清HBV RT區核苷酸序列，試劑盒購自上海申友生物技術有限公司。具體操作如下：第一，HBV DNA提取，將血清標本復溶，取200 μL血清加入同等體積HBV DNA提取液I，振蕩混勻，以13 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入 50 μL HBV DNA提取液II，充分混勻后短暫離心，100℃干浴或沸水浴10 min，振蕩混勻，以15 000 r/min離心5 min，取4 μL上清液DNA作為 PCR反應模板。第二，PCR擴增，在配制好的反應液中加入標本DNA、對照及定量參比品各4 μL，并在ABI 7500 PCR儀上設好反應程序：50 ℃ 2 min，94 ℃ 8 min，94 ℃ 7 s,60 ℃ 50 s，45個循環，72 ℃ 2 min。第三，PCR產物酶解，取3 μL PCR產物加入2 μL SAP MIX，充分混勻，37℃反應60 min，80 ℃反應15 min，將產物保存于4 ℃。第四，測序，取3 μL陽性PCR酶解產物與1 μL測序試劑和2 μL測序引物混合進行測序PCR擴增，反應程序為：94 ℃ 1 min , (94 ℃ 10 s, 50 ℃ 5 s, 60 ℃ 4 min)×30個循環，4 ℃下使用乙醇將其純化，并溶于甲酰胺溶液中。第五，DNA變性：在ABI 7500 PCR儀完成DNA變性，94 ℃ 5 min,4 ℃ 4 min。第六，基因測序及結果判斷，將上述產物置于ABI 3500XL型基因測序儀上進行測序，用配套軟件打開測序峰圖，對rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236、rt250共8個耐藥位點進行突變分析。

(三)HBV基因型檢測 將上述 HBV-RT區核苷酸堿基序列與美國國立生物技術信息中心基因數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formage.cgi)中信息進行比對，獲取HBV基因型。

三、統計學分析

結 果

一、慢性HBV相關肝病患者NAs耐藥突變分析

230例慢性HBV相關肝病患者中100例(43.47%)檢出NAs耐藥突變，以LAM/LdT耐藥最多見(30.00%,69/230)、ADV耐藥次之(7.83%,18/230)、ETV耐藥最少(5.65%,13/230)，三者比較差異有統計學意義(χ2=67.392,P<0.01)。在LAM/LdT耐藥中，單點耐藥55例(79.71%)，以rtM204V/I突變多見(17.39%,40/230)，其余還包括rtL180M突變8例和rtV173L突變5例；多點耐藥14例(20.29%)，以rtL180M+rtM204V/I突變多見(5.65%,13/230)，其余還包括rtL180M+rtM204V/I+rt V173L突變3例。在ADV耐藥中，以單點耐藥為主(11例,占61.11%)，rtA181T是其主要突變位點(3.91%,9/230)，其余還包括rt236T突變1例、rtA181T+rt236T突變2例、rtL180M+rtA181T突變2例和rtL180M+rtA181T+rt236T突變4例。在ETV耐藥中，均為多點耐藥，以rtM204V/I+rtA181T+rtS202G/I突變為主(3.04%,7/230)，其余還包括rtM204V/I+rtA181T+rtT184A/G/I/S突變3例、rtM204V/I+rtL180M+rtA181T+rtT184A/G/I/S+rt250V/I突變2例和rtM204V/I+rtL180M+rtA181T+rt236T+rt250V/I突變1例。

二、慢性HBV相關肝病患者HBV基因型分析

230例慢性HBV相關肝病患者均為B基因型和C基因型，未檢測到A、D、E、F、G、H、J基因型，其中B基因型患者162例(70.43%)，C基因型患者68例(29.57%)。

三、不同HBV基因型NAs耐藥突變情況比較

HBV B基因型和C基因型在rt180突變率和rt181突變率上比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，但其他位點突變差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

四、不同HBV基因型疾病進展情況比較

慢性乙型肝炎組B基因型和C基因型分別為114例和51例，乙型肝炎相關肝硬化組B基因型和C基因型分別為12例和28例，乙型肝炎相關肝癌組B基因型和C基因型分別為5例和10例，HBV基因型在3組分布比較差異有統計學意義(χ2=25.012,P<0.01)。

表1 不同HBV基因型NAs耐藥突變情況比較(例)

五、不同NAs耐藥突變疾病進展情況比較

慢性乙型肝炎組、乙型肝炎相關肝硬化組和乙型肝炎相關肝癌組在rt204耐藥位點上比較，差異有統計學意義(P=0.015)，但在其他位點上差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同NAs耐藥突變疾病進展情況比較(例)

討 論

研究表明，HBV疾病進展可能與基因型有關[9]。目前，根據HBV全基因序列差異≥8%和(或)S區基因序列差異≥4%進行分型，可將HBV基因型分為A-J10個基因型，而我國以B型和C型為主，其中南方以B型為主，北方以C型為主[10]。本研究中，230例慢性HBV相關肝病患者HBV B基因型約占70.43%，略高于張小曼等[11]的報道，可能與人群分布差異有關。此外，本研究還對比了HBV不同基因型患者疾病進展情況發現，HBV B基因型患者和HBV C基因型患者有一定差異，其中C型患者更易進展為肝硬化甚至是肝癌，可能是與C基因型患者HBV復制能力更強，肝功能損傷較重有關。

目前已明確的NAs耐藥模式有6種，包括L型核苷耐藥模式、無環磷酸鹽耐藥模式、共享(公共)耐藥模式、雙重耐藥模式、ETV初治耐藥模式和多藥耐藥模式[12]。由于經濟原因，我國以低屏障耐藥(LAM、LdT和ADV)為主，高屏障耐藥(EVT)為輔，但無論是何種，均不利于HBV相關肝病治療及恢復[13]。本研究對230例慢性HBV相關肝病患者NAs常見耐藥突變點進行檢測發現，以rt204位點突變占比最高，約69%，與國內主流意見基本一致，提示rt204位點突變者NAs耐藥率高，提醒臨床工作者可將HBV-RT區rt204位點突變檢測納入抗病毒療效監測中，以便及時調整治療方案，提高治療效果。此外，本研究還發現230例慢性HBV相關肝病患者中rt180和rt181突變也相對較高，提示以上兩者可成為耐藥監測的另一檢測指標。有學者發現，除了藥物本身，耐藥產生可能與病毒基因型具有一定關聯[14]；但也有學者發現B 基因型和C基因型患者在耐藥位點突變率上無明顯差異[15]。本研究發現，除rt180位點和rt181位點外，HBV B基因型和C基因型在其他位點的突變率無明顯差異，與上述觀點基本一致，也提示C基因型患者更易發生rt180位點和rt181位點突變，導致耐藥。此外，rt204位點突變對疾病進展更為重要，提示應重點關注rt204位點突變患者的疾病進展狀況，盡可能采取有效措施減緩其進程。

綜上，本地區慢性HBV相關肝病患者基因型以B型和C型為主，NAs主要耐藥突變點檢出率較高，其中不同基因型的疾病進展情況和耐藥突變情況存在差異，而在rt204耐藥位點突變率上不同疾病階段亦存在差異，建議HBV感染者常規進行基因型和NAs耐藥檢測，以便建立個體化治療方案，減緩疾病進程。本研究存在以下不足：①本地區樣本量不足，尤以乙型肝炎相關肝癌者缺乏；②研究對象均為本院患者，可能存在一定地區差異性。