尼帕病毒病

林志龍，嚴延生，張智芳，王曉歡，梁小潔

尼帕病毒病(Nipah virus disease，NVD)是由攜帶尼帕病毒(Nipah virus，NiV)的果蝠(Pteropusspp.)引起的一種人獸共患病，人發病后致死率可達32%～70%，甚至更高。NiV的宿主廣泛，Pteropus屬蝙蝠是尼帕病毒的天然儲存宿主，豬、馬等家畜是主要的中間宿主，人感染后可發生人-人直接傳播[1]。1998年9月馬來西亞首先報道發現由豬傳至人引發嚴重的呼吸道及/或腦炎綜合征[2]，1999年3月，新加坡從馬來西亞進口生豬引發12個屠宰工感染、其中1例病死的事件。馬來西亞和新加坡的疫情至1999年5月結束，約有116萬頭豬被捕殺，276人發病，107人死亡，病死率達38.8%，死者多呈腦炎癥狀[3]。在南亞和東南亞地區已發生12起NVD疫情，最近的一次疫情發生于2018年5月印度南部的Kerala邦，共確診19例，死亡17例，病死率為89.5%[4]。由于NVD病死率高，因此，該病已兩次被世界衛生組織(WHO)確定為優先研發和防控的病毒性傳染病[5-6]。我國目前尚無尼帕病毒病發生的報道，但我國南方部分地區處在Pteropus屬的地域分布區內，同時在地理位置上毗鄰東南亞和南亞疫情國家[7]，存在較高的輸入風險，加強該病的病原傳播方式、致病機制和防控策略等研究具有重要意義。

1 病原學特征

1.1NiV的形態、結構、分類和生物安全 NiV屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒屬(Henipavirus)兩個種中的一個，為單股負鏈非節段的RNA病毒。病毒呈球形，直徑150～200 nm，具有單層包膜，嵌有與受體結合的融合蛋白和糖蛋白抗原突起，基質蛋白排列于包膜下。NiV與副粘病毒科的其他種屬不同，但與同屬的亨德拉病毒(Hendra virus, HeV)密切相關，全基因組符合率達80%，其抗體與同屬的HeV能產生交叉反應，與其他副粘病毒科的種屬則不反應，此外，其他副粘病毒科的種(如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1, 3型等)感染的動物譜很窄，但NiV感染的動物譜較寬，除豬、馬外，還可感染狗、貓、山羊、野豬和嚙齒類等多種動物。廣譜感染的原因與其利用腎上腺素-B2及或B3(ephrinB2/B3)為受體有關，ephrinB2主要在神經元、內皮細胞、動脈周圍的光滑肌細胞、胎盤組織、脾及淋巴結竇小管內側細胞表達，而ephrinB3則主要在淋巴細胞中表達，這也就是NiV常引起急性淋巴細胞壞死的主要原因，此外，ephrinB2/B3作為受體在很多哺乳動物中都很保守[8-9]。由于NVD的高致死率，對NiV分離、鑒定等實驗操作必須在生物安全四級實驗室(biosafty laboratory level-4, BSL-4)進行[10]。

1.2NiV基因組與分子特征 NiV從動物分離和從人分離的基因組基本一致，但由于傳播方式的不同，NiV基因簇有所不同。如最早暴發疫情的國家馬來西亞，其為農業國，養豬是其出口生豬賺取外匯最主要的行業之一，果蝠→豬→人→人是馬來西亞NiV感染傳播的最主要方式；而孟加拉國則是穆斯林國家，不養豬，其傳播方式是以食用污染的棗棕櫚汁引起的感染為主，并導致人傳人疫情發生。所以，全基因組遺傳進化樹分為兩個簇，一是孟加拉簇(NiV-B),全長18 252 nts，另一為馬來西亞簇(NiV-M),全長18 246 nts，前者只比后者多6個核苷酸[10]。各個基因間的轉錄和終止信號高度保守，5′和3′末端也高度保守，分別為5′-UCCUUGGUUCU-3′和 3′-AAUUCUUUUU-5′。基因組共編碼6個結構蛋白基因，從基因組3′始依次為核衣殼蛋白(N)基因、磷酸化蛋白(P)基因、基質蛋白(M)基因、融合蛋白(F)基因、糖蛋白(G)和多聚酶(L)基因，這6個基因經翻譯后形成各自具有功能的蛋白，各基因間有不經翻譯、作用不詳、長短不均的核苷酸間隔(圖1)。NiV首先利用產生中和抗體的G蛋白吸附到侵染的細胞受體上并變構，由細胞蛋白酶將F蛋白裂解為F1和F2，細胞與含F1亞基結合，促使NiV病毒膜與細胞膜融合，使NiV基因組進入宿主細胞[7]；M蛋白在維持病毒的形態方面包括出芽生殖起作用；N、P和L蛋白附著在病毒RNA上形成vRNA。N是核衣殼，主要作用在于保護RNA鏈；L蛋白在NiV中含量雖少，但其具有RNA聚合酶活性，在病毒的復制和轉錄過程中發揮重要作用；P蛋白由3種重要的附屬蛋白組成，即C、V和W蛋白，C蛋白調節病毒RNA的合成和毒力因子的產生，V和W蛋白作用在于抑制干擾素誘導啟動子的激活，因此，這兩蛋白與毒株的毒力密切相關[11-12]。

1.3NiV的理化特征 NiV在一些果汁或芒果中能存活3 d，而在22 ℃下人工配制的棗棕櫚汁(13%蔗糖，0.21% BSA，pH 7.0)中能存活7 d，在果蝠尿中半衰期為18 h。NiV在中性環境中相對較穩定，70 ℃至少可存活1 h, 100 ℃ 15 min才可被滅活，但在酸堿環境中存活較差，肥皂和市售洗滌劑如次氯酸鈉等均可滅活NiV[13-14]。

2 流行病學特點

2.1NiV的儲存宿主和傳染源 蝙蝠是僅次于嚙齒動物的第二大類哺乳動物，也是唯一的一種能飛行的哺乳動物，目前分在翼手目(Chiroptera order)，下有兩大亞目，分別是體形及翼展較大的食果蝠亞目和體形及翼展較小的食蟲蝠亞目。從1998年在馬來西亞發現疫情至2018年5月印度的Kerala邦總共發生了12起NVD疫情，這些疫情由4種果蝠(P.vampyrus、P.hypomelanus、P.lylei和P.giganteu)引起[10]。在免疫學上，Zhou等(2016)[15]用人、馬、豬和鳥等臟器標本與澳大利亞黑頭果蝠P.alecto進行干擾素(interferons，IFNs)基因的比較，證實P.alecto有一個高度收縮的I型IFN家族，但比起其他哺乳動物的IFN，其位點小很多，并且該位點僅由10個IFN組成，包括3個功能性IFN-α基因，這3個IFN-α基因在未受感染與受感染的蝙蝠組織和細胞中均能穩定表達，表達IFN-α不受病毒感染的影響；穩定表達的IFN-α可誘導具有抗病毒活性和抗DNA損傷相關的IFN刺激基因(ISG)的產生，ISG也可與致命性病毒共存。P.alecto具有代表性，可以認為作為機體一線抗感染作用的IFN-α不起作用，這是蝙蝠能夠攜帶致命性病毒而本身又不得病的重要特征。作為天然宿主，果蝠可以把病原傳給中間宿主擴增或污染食物和環境造成其他動物和人的感染死亡，這就起到傳染源的作用。

圖1 尼帕病毒的分子結構[10]Fig.1 Structure of Nipah virus

2.2NiV的傳播方式 NiV從動物傳播給人的方式有4種：一是畜養的豬作為中間宿主傳播。在1998年初次暴發時，感染了NiV的果蝠通過唾液或尿液直接污染了豬食，豬感染病毒后產生呼吸道及神經系統癥狀，病豬再引起飼養員的感染，而病人的神經系統癥狀常被誤認為乙腦疫情，引起應對疫情的錯誤，最后造成人傳人的后果[2,16]。1999年3月，新加坡從馬來西亞進口生豬引發12個屠宰工感染的疫情，也是一次豬作為中間宿主的傳播。二是攜帶NiV的果蝠，其唾液或尿液污染了棗棕櫚汁，食用這種污染的棗棕櫚汁或其經發酵成含酒精的飲料造成了感染的發生。孟加拉國起先誤報疫情為果蝠不明原因的人傳人事件，與其近鄰的印度也發生類似事件，后用紅外線攝像復原了果蝠污染棗棕櫚汁的過程，才使得攜帶NiV的P.giganteu引起疫情發生的過程得到證實[17-18]。三是馬作為中間宿主傳播。2014年發生在菲律賓的疫情，傳染源最可能是果蝠，首先是馬被感染，再由馬傳給人，最后發生人傳人病例[19]。四是推測吸入源于高處棲息、感染病毒的果蝠體液(唾液或尿液)微滴而感染。2018年5月印度的Kerala邦疫情，在指示病例家附近捕獲了Pteropus屬52只、Rousettus屬12只和5只鳥， RT-PCR在Pteropus屬果蝠的喉和直腸棉拭子標本中檢出13只陽性，其中從3只陽性果蝠的肝、腎標本中用套式PCR擴出342 bp的核衣殼核酸片段，與從9個病例擴出的片段比較，其符合率為99.7%～100%，因此,推測本次NVD疫情是攜帶NiV的果蝠體液感染人后引起人傳人事件[20]。總之，這4種傳播方式最早的傳染源應該均為感染了NiV的果蝠(Pteropusspp.)，其唾液及尿液可以感染人。

2.3NiV傳播的易感人群 馬來西亞NVD疫情的暴發源于感染的豬，豬作為中間宿主又感染了飼養員，人發病后通過密切接觸的方式感染陪護者；而新加坡病例的傳染源為馬來西亞進口的生豬，因此把全國受影響的521個屠宰工集中，包括賣肉或其他密切接觸者在內約 1 469例進行抗NiV- IgM、IgG中和抗體檢測，感染者只集中在屠宰工中，檢測發現22例感染者，12例有肺炎和/或腦炎癥狀，10例為無癥狀感染者，其他人群均未被感染[21]。在孟加拉國，2001年至2007年期間，暴發了多起NVD疫情，病例都是飲用了被果蝠污染的棗棕櫚汁或其經發酵成含4～8度酒精飲料(當地稱為“tari”)的成年男性感染者及發病后陪護他們的密切接觸者。Fogarty等(2007)[17]證明飲用污染的棗棕櫚汁是疫情發生的主要原因。Islam等(2016)[22]從2010年12月到2014年3月醫院監測到的NVD疫情中，選擇14個傳染來源不明的病例進行流行病學調查，發現其中死亡的8個病例均為飲用“tari”的成年男性，余6例為女性陪護者。在印度Kerala邦疫情報告60～71 d后，對治療病例的155個醫護人員及124個密切接觸者進行為期21 d的抗體監測，只有3例陽性感染者(2例IgG、IgM陽性，1 例僅IgM陽性)[23]。因此，可以認為NiV的易感人群為接觸病豬的養豬職業者和愛好飲用污染的棗棕櫚汁及其制品者，與本病患者密切接觸的陪護者也是易感者，但未見密切接觸者感染死亡的報告。

3 致病機制

研究證實，在人發病早期NiV攻擊的靶點是支氣管上皮細胞(Bronchial epithelial cells)和II型肺泡上皮細胞(Type II alveolar epithelial cells)。在動物實驗模型中，從支氣管和肺泡上皮細胞中可檢出病毒。這些細胞被感染后可誘導釋放出炎癥細胞因子，如白細胞介素1a(IL-1a)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、CXC趨化因子10(CXCL10)等，導致急性呼吸窘迫綜合征樣(ARDS-like)疾病產生；隨著病情發展，病毒可從呼吸道上皮細胞浸潤進入肺部內皮細胞，其后病毒可與宿主白細胞結合的形式或由浸潤途徑進入血流，隨后，機體的肺、脾、腎及腦部成為靶點，引起肺、腎、心、腦等多器官的衰竭[24-25]。

有兩條獨特途徑可使病毒侵入中樞神經系統(central nervous system，CNS)，一是通過血液途徑(脈絡叢或大腦血管)，二是通過嗅覺神經元進入。由于CNS被病毒感染引起神經癥狀，結果造成血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的崩潰并促進白細胞介素1b(IL-1b)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)在腦內的表達，進一步惡化腦部癥狀；其次在CNS受感染的情況下，NiV增殖快，在腦部形成病毒包涵體，促使腦部灰質和白質斑塊的出現，致腦神經壞死[26-27]。

4 實驗室特異性檢測

亨尼帕病毒屬含有NiV和HeV兩個種，它們之間的遺傳符合率高達80%，因此，對這兩種病毒感染的疫情性質和病人的確診需要實驗室進行診斷區別。這兩種病毒屬于致命性病毒的范疇，病毒分離鑒定雖不難，但必須在生物安全等級最高的BSL-4實驗室進行。BSL-4實驗室數量很少，運行條件非常嚴格，因此，對臨床病例的確診、常規監測和流行病學調查主要依靠qRT-PCR和ELISA法。

4.1qRT-PCR NiV有6個蛋白基因，合成量最大的是N基因，因此，眾多學者多采用N基因作為一步法qRT-PCR的引物[26-28]進行檢測，由于N基因復制量大，作為確診的依據有保證，但也存在著與 HeV有交叉反應而無法確定基礎感染量的問題。Jensen等(2018)[29]依據病毒遺傳物質進入機體細胞需要G蛋白黏附變構與F蛋白裂解的機制，分別在NiV-M和NiV-B株設計了F間區與部分G區的引物，并設計了6羧基熒光素(6-FAM)和TAMURA引物。該一步法qRT-PCR比其他檢測N基因的一步法敏感性要低，不能用于監測和流行病學調查，但其能特異的區分NiV-M和NiV-B株的感染，而且能計算出病毒感染量與細胞病變的關系，這是其獨特之處。

4.2ELISA法 有兩種不同性質的ELISA檢測方法。一是測抗原，用捕獲抗原的方法檢出標本中的NiV抗原。Chiang等(2010)[30]用γ射線滅活NiV后免疫BALB/c小鼠獲得兩株分別抗N及P蛋白的單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，這兩株mAb可用于檢出NiV感染及區分HeV的感染；Kaku等(2012)[31]用抗NiV N蛋白的兔多克隆抗體(polyclonal antibody，pAb)進行NiV感染的診斷。二是測抗體，用重組全長的N蛋白和截短的克隆的G蛋白檢測豬血清中抗NiV抗體[32]。這兩種方法不同之處：前者在聚乙烯板上包被的是mAb或pAb，檢測的是抗原，多用于臨床病例的診斷；而后者在板上包被的是克隆的抗原，檢測的是抗體，可用于常規監測及流行病學調查。

5 臨床癥狀及治療

果蝙感染NiV后，不論是傳給豬或馬或污染棗棕櫚汁，最后均引起人的感染，但不同傳染途徑產生的臨床癥狀有所不同，NiV-MY主要引起腦炎，而NiV-BD主要引起嚴重的肺炎癥狀。人感染NiV后，潛伏期3～14 d不等，共有癥狀一般從發熱開始，很快發生高熱。發熱后出現昏睡和頭疼，出現腦炎癥狀，產生節段性肌陣攣、反射減弱或消失、肌張力低下等神經系統癥狀，最終在1～2 d內發展為休克等腦炎并發癥；肺炎癥狀在發高熱時期一般表現為非典型肺炎，伴隨咳嗽、嘔吐、肌痛、呼吸困難等癥狀，有些病例可能出現敗血癥、腎衰、胃腸道出血等嚴重并發癥。患腦炎癥狀者，也多有表現為呼吸窘迫[33-34]。

治療藥物方面，第1類是趨向性治療藥物：mAb。以NiV表面的F和G蛋白為靶點，Guillaume等(2004、2006、2009)[35-37]先后研制出鼠源性mAb和pAb，首先用于被動免疫治療倉鼠為模型的NiV感染；Geisbert等(2014)[38]研制出全人源化的具有中和抗體作用的mAb m102.4，該單抗也可用于非人靈長類(非洲綠猴)抗NiV感染的免疫治療，研究結果是治療組所有12只感染了NiV的非洲綠猴全部存活，而對照組中10只非洲綠猴就有8只死亡，其治療效果十分明顯。第2類是化學合成藥物：一是利巴韋林(ribavirin)，在2018年印度南部Kerala邦的疫情有使用，但需要很嚴格的其他支持療法的配合；二是法匹那韋(favipiravir)(T-705)，其藥理作用是作為RNA聚合酶抑制劑，使NiV難以復制，在動物(倉鼠)研究中法匹那韋可產生完全保護效果[39]；三是正在研究的脂肽酶抑制劑，Mathieu等(2018)[40]證實該藥物可作用于F蛋白，使NiV遺傳物質不能進入細胞。這3種化學合成藥物除第1種臨床治療有用過外，其他2種還未用于人體治療。此外，NVD恢復期患者血漿經檢驗合格也可以用于治療。

6 防控策略

防控策略包括4個方面：一是做好宣傳教育工作，提倡“One Health”,即多學科共同合作使人類、動物和環境3者成為一個健康整體。政府部門要加強動物、人和環境衛生的重要性認識，切實加大新發傳染病防控的宣傳教育和研發手段，這是防止發生此類高致命性傳染病至關重要的一個方面。二是加強疾病監測。對馬來西亞養豬場的豬監測表明，豬感染NiV可引起從溫和到嚴重疾病的產生，病豬的死亡率約為1%～5%[41],對豬病來說，其病死率不是很高，但其可致飼養員的感染，最終致人傳人發生。因此，養殖場所要遠離蝙蝠的棲息地，同時應對果蝠開展病毒抗體的監測，并在該地區設點對人類開展監測。三是要充分做好國際合作，密切監視疫情的發生發展，按要求嚴格做好國際衛生檢疫，防止感染但未發病的患者或病畜流入國內。四是加強疫苗研發。由于該病的高致死率，WHO已兩次提議對包括該病在內10種人獸共患病予以優先研發(R&D)。對該病而言，已知其流行期短，很難進行完整的臨床試驗。因此，對于人類這種高致死性疾病，起碼應在實驗室研究及可能的情況下研發出可產生中和抗體的疫苗作為應急疫苗備用。

7 討論與展望

蝙蝠分離株RaTG13全基因組序列與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)比較，相符率為96.2%，因此推測蝙蝠可能是SARS-CoV-2的宿主。而果蝠已證實是尼帕病毒病的傳染源，可見蝙蝠與多種新發傳染病關聯緊密。石正麗團隊[42]曾于2004—2007年從我國10個省捕獲了9個種的蝙蝠，其中既有食果蝠也有食蟲蝠。其中采集血液標本692份，咽拭子和肛拭子各為67份和479份。在692份血液標本中檢出33份尼帕病毒抗體陽性標本，其中25份陽性標本中有17份經重組的尼帕病毒Western Blot試驗所證實。但從67份咽拭子和479份肛拭子中均未能擴出尼帕病毒核酸。2006—2007年該團隊從云南同一個地方的3種鼠耳蝠(Myotis)中均檢出尼帕病毒抗體，而2007年從海南省的棕果蝠(Rousettusleschenaultia)中也檢出尼帕病毒抗體。這說明一方面尼帕病毒確已感染我國的蝙蝠，但另一方面因檢測時間等緣故，未能檢測到中和抗體及尼帕病毒核酸，提示我們要設點進行常規監測，以保證我國對該病的安全防控。

利益沖突：無