p53的翻譯后修飾及其與砷中毒致人體多器官損傷關系的研究進展

劉春燕，張愛華

(貴州醫科大學公共衛生學院，環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

p53 作為細胞生命活動中重要的監視基因之一，在細胞周期阻滯、DNA修復、氧化應激、自噬、衰老及凋亡等信號轉導途徑中具有重要的調控作用，p53 介導的信號轉導途徑與其翻譯后修飾有著緊密聯系。砷作為自然界中廣泛存在的有毒類金屬元素，人體長期暴露于砷污染的飲水、空氣及食物所引起的砷中毒可致皮膚、肝、腎、肺等多器官損傷，因其健康損傷嚴重，加之致病機制不明和無特效治療藥物，成為制約砷中毒致人體多器官損傷防治的瓶頸，故研究砷毒性機制對尋找砷中毒致人體多器官損傷的治療藥物具有重要意義。近年來有關砷毒性機制的體內外研究表明，p53 突變、轉錄活性、穩定性、胞內定位等在砷毒性機制中具有重要的作用，而p53在砷毒性機制中發揮的調控作用與其受到泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等多種翻譯后修飾密切相關。因此，本文對p53的翻譯后修飾及其與砷中毒致人體多器官損傷的關系進行綜述，為進一步認識p53在砷中毒致人體多器官損傷中的作用和作為潛在治療靶點的應用提供依據。

1 p53的修飾與功能

大量研究證實，p53 在響應多種脅迫應激反應中可表現出不同的功能，而p53 呈現功能的多樣性與p53 受到泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等多種翻譯后修飾密切相關，這些修飾對p53穩定性、轉錄活性、胞內定位、突變等具有重要的調節作用。

1.1 泛素化修飾對p53功能的調節

泛素化修飾指一個或多個泛素分子在一系列泛素酶的作用下與底物蛋白共價結合的一種蛋白翻譯后修飾過程，泛素化修飾后的底物蛋白可通過蛋白酶體等途徑降解，該修飾是調控蛋白表達水平及活性的重要機制。鼠雙微基因2(murine double minute，MDM2)是調控p53功能的一個重要E3泛素酶，研究顯示，MDM2 通過直接結合p53 轉錄激活區并將其單泛素化或多泛素化致p53 失活是腫瘤惡性轉化較典型的事件之一，50%～60%的癌癥與p53 失活有關。應激信號通過激活p53 介導MDM2 表達增加，反過來，增加的MDM2 負調節p53 活性，使得細胞不至于因過高活性的p53 而引起損傷，然而，MDM2 對基礎水平p53的維持有利于生理狀態下細胞內穩態的平衡。除經典的p53-MDM2 反饋環外，含有RING-finger 結構域的E3 泛素樣酶可與p53 相互作用并誘導其多泛素化，進而促進如胃癌、結直腸癌細胞增殖，然而，另有研究顯示，泛素樣酶MSL2(male-specific lethal-2)對p53 K351和K357的泛素化修飾并不影響其降解，但與胞漿定位密切相關。不同條件下，p53泛素化修飾的差異調節還有待進一步研究，其中常見的p53泛素化修飾位點如圖1所示。

1.2 磷酸化修飾對p53功能的調節

圖1 p53常見的翻譯后修飾類型及修飾位點

磷酸化指由蛋白質激酶催化的把ATP的磷酸基轉移到底物蛋白氨基酸殘基或者在相關信號作用下結合GTP的過程，對蛋白活力具有重要的調節作用。磷酸化修飾作為研究較多的p53修飾類型與p53轉錄活性、穩定性、細胞器定位及構象等密切相關。p53 磷酸化位點橫跨整個結構域，常見的磷酸化修飾位點如圖1 所示，其中p53 絲氨酸(serine，Ser)是研究較多的磷酸化修飾類型，p53 Ser15、p53 Ser20(小鼠p53Ser18、p53Ser23)被共濟失調毛細血管擴張突變(ataxia telangiectasia-mutated，ATM)激酶和檢查點激酶1/2(checkpoint kinase 1/2，Chk1/2)磷酸化以保護p53 免受主要負調節因子MDM2 的降解，進而增強其穩定性和轉錄活性，這一機制在p53 Ser18 突變型小鼠的胸腺和脾細胞及p53 Ser23 突變型小鼠的胸腺細胞和發育的小腦中得到驗證。酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)引起的級聯酶促反應介導的p53 Ser6、p53 Ser9 的磷酸化可致p53與轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路相互串擾，共同調節胚胎發育以及腫瘤發生過程中相關基因的表達。周期素依賴蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，CDK5)對p53 Ser15、p53 Ser33、p53 Ser46 的磷酸化修飾通過增強p53 的轉錄活性和穩定性誘導神經細胞死亡。蘇氨酸(threonine，Thr)155 的磷酸化修飾是Jun 激活區域連接蛋白1(c-Jun activation domain-binding protein1，Jab1)介導 p53 核輸出的重要因素。目前，盡管DNA結合結構域中磷酸化修飾位點對p53 功能調節的研究有限，但有研究表明此區域是ChK1/ChK2等激酶的停泊位點，有助于p53 Ser20等其他位點的磷酸化修飾。p53 C 端(Ser315，Ser376，Ser392)磷酸化修飾的作用在于使p53 蛋白構象發生改變，以致p53 從“潛伏”狀態轉變為具備DNA結合能力的活性狀態。

1.3 乙酰化修飾對p53功能的調節

乙酰化修飾指在酶(或非酶)的作用下將乙酰輔酶A 的乙酰基團轉移至蛋白氨基酸殘基上的過程，是一種可逆的蛋白翻譯后修飾。乙酰化修飾通過改變賴氨酸殘基上的電荷及蛋白構象，從而影響蛋白活性、DNA 結合親和力和蛋白穩定性等。p53 有多個可發生乙酰化修飾的位點，其主要的乙酰化修飾位點如圖1 所示。DNA 結合域和C 末端域的乙酰化修飾防止p53被泛素化降解，對增加p53 穩定性、促進p53 與靶基因結合增強其轉錄活性以及維持p53穩定性等功能具有重要作用。p53作為轉錄因子通常需一系列轉錄共激活因子或轉錄共抑制因子的協助參與調控下游靶基因的轉錄，p53 C端的乙酰化修飾通過招募轉錄共激活因子或轉錄共抑制因子是調控p53轉錄活性及下游靶基因表達的重要因素。體外研究發現，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶SET 作為p53 的轉錄共抑制因子，應激誘導p53 C端乙酰化水平的升高可顯著抑制p53-SET的相互作用及SET在p53 下游靶基因啟動子區的富集進而促進p53 轉錄活性，且p53 C 端的乙酰化修飾對p53-SET 相互作用的抑制在

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基因敲入小鼠模型中也得到驗證，此體內外結果對開發針對該機制的藥物研究具有重要意義。

1.4 甲基化修飾對p53功能的調節

甲基化修飾指從活性甲基化合物上將甲基經酶催化轉移到其他化合物進而形成各種甲基化產物。蛋白質甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質序列中的甲基化，蛋白甲基化可調控蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA或蛋白-RNA相互作用、蛋白穩定性、亞細胞定位或轉錄活性。研究表明，SET7/9 可誘導p53 K372甲基化修飾，此修飾可穩定p53并使其滯留在細胞核，參與調節p21 等靶基因的轉錄，然而，也有研究顯示，SET8 對p53 K382 的單甲基化及組蛋白甲基轉移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)對p53 K370的甲基化可衰減p53與靶基因啟動子的結合，從而抑制其轉錄活性，相反，賴氨酸乙酰轉移酶PHF20(plant homeodomain finger 20)介導的p53 K370或K382 二甲基化可增強p53 穩定性和轉錄活性。除賴氨酸甲基化外，p53 上的精氨酸也可發生甲基化，蛋白精氨酸甲基轉移酶 5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)對 p53 及p53 結合蛋白的甲基化修飾參與調控p53 與靶基因的特異性結合。p53主要的甲基化修飾位點如圖1所示。

1.5 修飾的串擾對p53功能的調節

如上所述，p53 有眾多可被修飾的位點，這些位點的修飾可調節p53 穩定性、胞內定位及轉錄活性等功能。有趣的是，與p53 Ser18 或p53 Ser23 突變型小鼠的胸腺細胞、脾細胞相比，p53 Ser18 或p53 Ser23 突變型小鼠的胚胎成纖維細胞其p53依賴的細胞周期阻滯和p53穩定性并不受γ射線、電離輻射刺激的影響，此體內外結果的差異提示，在特定刺激或不同靶器官中，不可否認p53 Ser15、p53 Ser20(小鼠p53 Ser18、p53 Ser23)磷酸化修飾可增加p53穩定性，但對于體內p53穩定性的調控可能存在一個更為復雜而精細的作用網絡，而不是靠單一的磷酸化修飾就可完成。p53 Ser15、p53 Thr18、p53 Ser120和p53 Ser137磷酸化的結合可通過招募CBP/p300增加p53的乙酰化修飾水平，進而增強其轉錄活性，相反，泛素樣酶E4F1(E4 transcription factor 1)和賴氨酸乙酰轉移酶PCAF(P300/CBP-associated factor)可競爭性結合p53 K320，且E4F1 對p53 K320 的泛素化可緩解PCAF 對K320 的乙酰化作用，進而阻斷p53 的轉錄活性。N-乙酰轉移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)不僅乙酰化p53 K120 還泛素化p53 負調節因子MDM2，協同增強p53 穩定性，且p53 的乙酰化可阻斷SET 對其甲基化的調控，另有研究發現，SET7/9 對p53 K372 的甲基化修飾導致其乙酰化水平增加對調節p53 穩定性和轉錄活性至關重要。這些研究表明，各位點可實現多種不同的修飾，各種修飾之間的交互作用可能是p53執行功能的決定性因素，可將這些串擾分為6 大類：同種修飾相互作用、鄰近修飾相互作用、協同修飾相互作用、異種修飾相互作用、遠端修飾相互作用、拮抗修飾相互作用。

2 p53 的翻譯后修飾與砷中毒致人體多器官損傷的關系

p53 的表達及活性受到磷酸化、乙酰化、甲基化及泛素化等多種翻譯后修飾的共同作用。近年來，國內外學者以細胞、動物實驗為主，并充分結合有限的人群樣本對有關p53翻譯后修飾在砷中毒致人體多器官損傷中的作用進行研究后發現，砷中毒對p53 翻譯后修飾的調節致p53 轉錄活性、細胞定位、穩定性的改變參與了砷中毒致人體多器官損傷進程，機制研究發現 ， 1 μmol/L NaAsO可 降 低 p53 Ser15、 p53 Ser46、 p53 Ser392磷酸化水平和p53 K382乙酰化水平，p53磷酸化及乙酰化修飾水平的降低通過削弱p53與DNA的結合能力并抑制下游靶基因的表達進而促使人角質形成細胞(HaCaT)惡性轉化，另10 μmol/L NaAsO致人乳腺上皮細胞(MCF-10A)惡性轉化與誘導MDM2 表達增加和p53 Ser15 磷酸化水平降低有關。p53的翻譯后修飾除參與砷中毒致細胞惡性轉化外，也可通過誘導細胞凋亡進而導致器官損傷，研究發現，砷中毒可通過增加大鼠肝組織中p53 Ser20 磷酸化水平及其介導的線粒體凋亡通路致肝細胞凋亡，體外研究顯示，10 μmol/L NaAsO誘導人胚肺成纖維細胞(HELF)及HaCaT 細胞凋亡，其凋亡機制與促進p53核移位、增加p53穩定性和轉錄活性等功能有關，且最近的一項證據表明，高劑量砷不僅增加p53 熱力學穩定和轉錄活性，甚至對發生結構型突變的p53仍能保持三級結構以及抑癌功能活性。盡管p53的翻譯后修飾對p53功能的調節在砷中毒多器官損傷中的作用機制尚不完全清楚，但已發現砷對p53翻譯后修飾的調控與p53 功能有著緊密聯系，而p53 功能的變化決定了砷通過誘導細胞惡性轉化導致機體癌變還是通過誘導細胞異常凋亡進而參與機體損傷。在燃煤型砷中毒患者皮膚損傷中發現，p53 陽性表達率與燃煤型砷中毒患者皮膚損傷的臨床分級和病理分型相關，但也發現燃煤砷中毒可致人體外周血

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基因啟動子區高甲基化、第5外顯子低甲基化和突變。對來自西孟加拉邦高砷污染地區的162名角化病患者發現，砷中毒相關的器官損傷(周圍神經病變、結膜炎和呼吸系統疾病)和遺傳損傷與p53第72位精氨酸突變有關。這些研究從多層面揭示了p53在砷中毒多器官損傷中的作用復雜，結合體內外機制研究推測，這可能與p53 翻譯后修飾的復雜性及不同砷濃度有關。

3 展 望

綜上所述，p53 存在著多種翻譯后修飾，其翻譯后修飾的多樣性、復雜性及可逆性決定了量化p53功能的困難性，研究者需要根據自己的研究背景，抽絲剝繭，分清主次，找出砷致機體損傷中p53的動態變化形式及占主導地位的修飾類型，為臨床應用提供依據。另在砷毒性刺激下，p53 與其他信號轉導途徑有著怎樣的交互聯系？對其深入研究，將補充砷中毒致人體多器官損傷等復雜性疾病致病機制的進一步認識。鑒于p53翻譯后修飾及介導p53功能的變化參與了砷中毒多器官損傷進程，因此，靶向p53相關修飾位點或修飾酶可能是預防和治療砷中毒致多器官損傷的又一選擇。在過去十幾年里，盡管靶向MDM2-p53反饋環的小分子藥物研發遭遇了挫折，但隨著結合肽類、靶向降解劑以及mRNA療法的不斷發展，給p53-MDM2的藥物研發帶來新機遇，目前處于臨床階段的MDM2抑制劑如ALRN-6924、BI907282、Idasanutlin 等備受關注。近年來，國內外學者利用天然植物藥進行砷中毒防治探索發現，刺梨制劑、銀杏制劑、姜黃素等天然植物藥對砷中毒引起的肝、腎、神經毒性及免疫失衡的保護作用與調節氧化應激、自噬、炎性反應等密切相關。鑒于這些信號與p53之間的緊密聯系，探討相應天然植物藥對p53翻譯后修飾及功能的調節對開發砷中毒多器官損傷治療藥物具有重要意義。