從原子到分子和細胞的電感耦合等離子體質譜絕對定量分析

嚴曉文，張 博，楊利民，陳 石，王秋泉

(廈門大學化學化工學院，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，福建 廈門 361005)

化學元素周期表中的穩定同位素普遍存在于生命體中[1]，或為生命必需元素，或為生命運行過程的輔助因子，或為產生異常行為或疾病的罪魁禍首.為了適應賴以生存的環境變遷，生命體吸收利用有益元素或鈍化有害元素[2-8]以延續生命進程.以有害元素汞(Hg)為例，為抵御Hg的侵害,動植物都進化了各自的抵御機制.在發展元素分析方法的基礎上[9-12]，我們發現與其他有害元素相比，Hg的毒性主要體現在與含巰基(—SH)分子的相互作用[13-15]，形成—Hg—S—準共價鍵(鍵長0.251 nm，鍵能217 kJ/mol，穩定常數在1035～1044數量級)，干擾正常生理活動甚至致命.從研究角度看，設計合成尺寸不同的Hg標簽，可對生物大分子所含的自由—SH和二硫鍵—S—S—進行精準測定[16]，并探測自由—SH所在生物分子的活性域位點[17]，深化對Hg的毒性機制和生物本身固有的抵御Hg侵害途徑的認識，為相關治療藥物的設計和研發提供新思路.此外，Hg的這一特性啟示我們可以利用Hg來標記生物分子，經原子光譜或電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)對Hg的測定實現對生物分子的定量分析[18-20].在原子光譜分析技術的發展過程中，人們逐漸意識到ICP不僅可作為原子發射光譜的光源，還可為已處于激發態的原子提供更多能量，使其進一步離子化，用MS讀出同位素離子信號，從而誕生了具有更高靈敏度、更寬線性范圍和同位素檢測能力的ICP-MS (圖1)[21].遺憾的是，Hg在ICP中的離子化效率只有不到40%，限制了其檢測靈敏度的提高；而且Hg的毒性嚴重制約了其廣泛使用的可能性.要使原本以元素分析為主要目標的ICP-MS發展成為生物分子的分析工具，充分發揮ICP-MS的靈敏準確且可提供同位素信息的優勢，將難檢測的、含量極低的關鍵生物分子的絕對定量轉變為元素的ICP-MS分析，必須要有新的思路和策略(圖2)[22-25].

圖1 ICP-MS的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of ICP-MS

利用抗原和抗體間的免疫識別能力，通過測定標記在抗體上的金屬元素可以實現抗原分子的分析[26-28].在關注生物分子的組成、結構和構象時，我們發現生物大分子中很多特定的官能團，特別是蛋白質分子的氨基酸殘基和翻譯后的修飾基團，可以直接進行化學修飾，用以明確化學計量比的共價標記[23,29]；而且生物在不斷的進化過程中所發展的自身代謝機制和伴隨的蛋白質機器網絡，為在生物大分子中組裝帶有可后修飾基團的關鍵分子模塊提供了可能性[30]；此外，對于集成了眾多生物分子的細胞，可以針對其自身所集成的生物分子進行化學選擇性或生物特異性元素標記，實現細胞分析[31]；利用核酸的堿基互配原理和聚合酶鏈反應信號放大策略實現單病毒水平的計數[32]；元素編碼標記的病毒納米衣殼蛋白顆粒又可作為生物分子或細胞分析的信號倍增器[33]，實現單細胞表面生物分子的定量檢測.

圖2 從原子到分子、細胞的ICP-MS分析方法學Fig.2 Analytical methodology using ICP-MS from atoms to molecules and cells

1 蛋白質生物標志物分子分析方法學

1.1 化學選擇性標記策略

基因組學的研究表明，人類基因編碼的蛋白質分子中約96%都含有至少1個半胱氨酸，其巰基可被如前所述的Hg標簽所標記[18-20]，也可與馬來酰亞胺(maleimide, MAL)以1∶1的化學計量比選擇性反應.我們選擇含有MAL基團的大環分子MAL-DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-trisacetic acid-10-maleimidoethylacetamide)，其中MAL作為反應基團，DOTA可配位裝載生物背景極低、在ICP-MS中離子化效率極高的非放射性鑭系元素(lanthanides,Ln: La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Yb,Lu)，獲得MAL-DOTA-Ln元素標簽(圖3).以Eu標簽為例，與高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)聯用，通過形態非特異性同位素稀釋(species-unspecific isotope dilution,SUID) ICP-MS對Eu的測定來實現完整蛋白質生物標志物分子的絕對定量分析(圖4)[34].

圖3 MAL-DOTA-Eu標記的巰基結構Fig.3 Structure of MAL-DOTA-Eu labeled —SH

圖4 胰島素A鏈、胰島素B鏈、核糖核酸酶A和 溶菌酶的151Eu和153Eu 色譜圖(a) 及由其轉變而來的Eu質量流圖(b)[34]Fig.4 151Eu and 153Eu isotope chromatograms of the A chain of insulin,B chain of insulin,ribonuclease A, and lysozyme (a) and Eu mass flow chromatogram translated from them (b)[34]

1.2 生物特異性標記和選擇性釋放策略

化學選擇性元素標記是針對生物分子中某一可化學修飾的基團(如—SH)展開的，而ICP-MS元素分析檢測的是所標記的原子.如果針對所有目標生物分子的相同基團標記同一種元素，生物分子則應以“時間分辨”的方式依次進入ICP-MS中進行檢測，這時基線分離就非常必要了.雖然各種各樣的分離技術和新型色譜固定相材料已有長足的發展[35-43]，但是要想分離復雜樣品(如蛋白質組樣品)中的所有組分并間隔排列地送到ICP-MS中，目前尚有難度.因此，為降低分離難度，針對目標生物分子靶向進行元素標記是一個可行的途徑.我們基于蛋白酶活性抑制原理，發展了針對絲氨酸蛋白酶家族(serine proteases,SPs)成員的絕對定量分析方法.首先對廣泛采用的4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟抑制劑分子中的磺酰氟基團(—SF)進行炔基(alkyne,ALK)化修飾獲得SF-ALK，并通過點擊化學(click chemistry,CC)反應將N3-DOTA-Eu與SF-ALK鏈接，獲得靶向SPs的活性抑制Eu標簽分子(SF-DOTA-Eu)(圖5)，實現了細胞和組織中胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的定量檢測(圖6)[44].運用類似的策略，設計制備一個針對人類P450酶家族中CYP3A4具有選擇性活性抑制的雙功能己基化17α-炔雌二醇-DOTA-Eu探針，實現了CYP3A4的選擇性定量和活性評價(圖7)[45]；針對組織蛋白酶活性位點上的半胱氨酸設計環氧開環抑制劑分子-Eu探針“標尺”，不僅可以對細胞溶酶體中組織蛋白酶的活性進行評價，而且實現了溶酶體的pH檢測(圖8)[46].將化學選擇性捕獲標記和生物酶選擇性釋放策略相結合可極大地提高分析方法的選擇性.針對蛋白質酪氨酸磷酸化(pY)的選擇性分析，我們將雙鎵配合物(Ga-complex)經一個光刻裂解基團鏈接組裝到Fe3O4@SiO2—COOH磁性納米顆粒表面，Ga捕獲所有含磷酸基團的生物分子，再利用酪氨酸磷酸酶PTP-1B選擇性釋放Ga-pY，最后由HPLC/71Ga-SUID-ICP-MS實現pY的定量分析(圖9)[47].

圖7 P450酶家族中CYP3A4的選擇性定量和活性評價[45]Fig.7 Selective quantification and activity evaluation of CYP3A4 in P450 enzyme family[45]

1.3 生物特異性免標記策略

(a)環氧琥珀酰-LYK-ALK對組織蛋白酶活性域中Cys25的不可逆共價標記,以及L和Y與活性域中氨基酸的 相互作用放大圖；(b)153Eu-SUID-ICP-MS檢測pH依賴的組織蛋白酶活性.圖8 環氧琥珀酰基-LYK-ALK活性抑制和N3-DOTA-Eu的點擊標記[46]Fig.8 Epoxysuccinyl-LYK-alkyne inhibitory and clickable N3-DOTA-Eu tagging[46]

圖9 集標記、富集和紫外光-釋放磷酸化或含磷酸基團分子/離子功能于一體的光可裂解磁性Ga-標簽， 以及酪氨酸磷酸酶PTP-1B輔助下pY的HPLC/71Ga-SUID-ICP-MS選擇性定量[47]Fig.9 Photocleavable magnetic nanoparticles-based Ga-tag for tagging,enrichment,and UV-release of phosphorylated and phosphate-bearing molecules/ions and pY selective quantification using HPLC/71Ga-SUID-ICP-MS under the assistance of a protein tyrosine-specific phosphatase PTP-1B[47]

蛋白酶分子具有特異性切斷其底物多肽序列的特性.我們針對目標蛋白酶設計了兩端分別編碼DOTA-Ln MS報告基團和分離“抓手”彩色納米顆粒的多肽底物；當樣品中存在目標蛋白酶分子時，就會專一性切斷底物多肽同時釋放DOTA-Ln，繼而通過ICP-MS定量分析Ln，實現蛋白酶分子的定量和活性評價(圖10)[48].這種生物專一性的蛋白酶分子分析平臺的構建實現了蛋白酶分子的免標記定量分析，充分發揮了ICP-MS同時多元素分析的特性，克服了光分析方法存在的光學信號穩定性不足和光譜重疊干擾的缺點.在這一ICP-MS分析平臺上可以開展很多針對蛋白酶的研究工作，如酶抑制劑藥物的高通量篩選等.

(a)Ln編碼的蛋白酶特異性納米探針的設計合成，其中 Bpy.2,2′-聯吡啶,EDC.乙基-N′-[3-(二甲氨基)丙基] 碳二亞胺鹽酸鹽,NHS.N-羥基丁二酰亞胺；

以上針對蛋白質生物標志物分子所發展的化學選擇性和生物特異性元素標記策略使得ICP-MS不僅充分發揮其元素分析的特長，而且使其應用拓展至生物分子分析領域.相比于電噴霧離子化/基質輔助激光解離電離質譜(electrospray ionization/matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry,ESI/MALDI-MS)等軟電離源MS，ICP-MS具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，使用簡單的單一富集同位素標準即可實現多種生物分子的絕對定量分析.需要指出的是，所發展的分析方法學不僅限于我們研究中所涉及的生物分子，也適用于其他重要的蛋白質標志分子的分析.

2 病毒、細菌和細胞分析

區別于上文的生物分子分析，細胞集成了多種生物分子.病毒、細菌和細胞直接分析獲取的結果是不同生物分子協同作用的綜合反映，為生物醫學研究和臨床診斷提供了實驗證據.

2.1 核酸介導的病毒分析

病毒的結構相比于哺乳動物細胞相對簡單，其中核酸(DNA/RNA)常用于病毒分析.利用核酸的堿基互配選擇性，我們針對人類免疫缺陷病毒、甲肝和乙肝病毒的核酸保守序列設計單鏈捕獲DNA(ss-Cap-DNA)并修飾在磁性納米顆粒上；編碼有Ln的報告DNA[ss-Rep-DNA-DOTA-Ln(Eu,Tb,Ho)]，經DNA滾環擴增(rolling circle replication,RCA)信號放大，通過Eu、Tb和Ho的ICP-MS定量實現了百余個病毒拷貝的檢測，為病毒的高靈敏準確計數提供了一個新方法(圖11)[32].

圖11 DNA介導的病毒ICP-MS分析[32]Fig.11 DNA-mediated analysis of viruses using ICP-MS[32]

2.2 非天然氨基酸代謝和CC介導的單細菌分析

細菌區別于其他生命體的一個特點是其含有支撐細胞壁的肽聚糖(peptidoglycan,PG)結構.PG可以看作是一個完整的高分子，由D-Ala交聯L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys/m-DAP-D-Ala-D-Ala(Ala.丙氨酸；Glu.谷氨酸；L-Lys.革蘭氏陽性菌；m-DAP.革蘭氏陰性菌)形成.生物學研究表明，細菌可利用自身的蛋白質機器將非天然的D-Ala代謝組裝到PG中.我們利用細菌的這一特性，采用炔基化的二肽ALK-D-Ala-D-Ala為底物，代謝組裝ALK-D-Ala到細菌細胞壁中，通過生物正交的CC反應將N3-DOTA-Eu標記在細菌細胞壁上，實現了細菌的元素標記.由于有至少105的ALK-D-Ala代謝到細菌細胞壁中以及定量的CC反應效率，相對于單個細菌，通過對Eu的ICP-MS檢測可以實現5個數量級的信號放大；利用標記有不同Ln的細菌多克隆抗體，又可以對所定量的細菌種類進行識別鑒定.這一方法學的發展為細菌分析開辟了一條新途徑，可以實現多種細菌的同時定性和定量分析(圖12)[49].

(a)ALK-D-Ala-D-Ala二肽代謝組裝N3-DOTA-Eu標記和La、Pr、Nd、Sm及Gd編碼的細菌多克隆抗體識別， 以大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)， 痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)為例；(b)151/153Eu、139La、141Pr、142Nd、152Sm和160Gd單細菌ICP-MS分析.圖12 非天然氨基酸代謝和CC介導的單細菌ICP-MS分析[49]Fig.12 Unnatural amino acid metabolism and CC mediated single bacterial ICP-MS analysis[49]

2.3 單細胞分析平臺和信號倍增策略

細胞群體分析在一定程度上體現了細胞的平均行為，并不能反映細胞間的差異.作為生命基本單元的細胞集成了多種生物分子，這些生物分子的協同作用決定了細胞的正常生理特性和病變征兆.單細胞分析不僅可以探明細胞間的行為差異，而且可為理解細胞間差異的生物學來源和精準的疾病診斷提供確切依據.除了發展針對細胞表面生物分子靶向標記策略外，對于真正意義上的單細胞分析還需要解決兩個必須面對的問題：1) 單細胞的分選和有序排列，2) 提高檢測靈敏度以滿足單細胞分析的要求.為此，我們設計制作了無油(NH4HCO3)微流控芯片操控細胞有序排列(可調控通量為400～25 000 min-1)，設計制作了直接注入式細胞進樣接口提高細胞的傳輸(100%)和檢測效率(大于70%)，僅僅采用可熱分解的NH4HCO3溶液來調控細胞間的間隔時間，一方面降低油-水液滴包裹細胞方法對后續MS檢測的干擾,另一方面與MS的檢測速度相匹配(圖13)[50].提高檢測靈敏度對單細胞分析尤為重要.利用噬菌體MS2衣殼蛋白可修飾氨基酸殘基的特點，我們發展了可控修飾元素報告標簽和靶向基團的策略，獲得了具有明確Ln原子個數的MS2納米顆粒，作為ICP-MS檢測的信號倍增器，靈敏度提高的數倍與Ln的個數相當.在具體針對KB細胞分析時，MS2衣殼蛋白上可以修飾1 000個Eu，相比于單純使用DOTA-Ln配合物分子，靈敏度提高了3個數量級(圖14)[33].單細胞操控分析平臺的搭建和病毒樣納米顆粒信號倍增策略的發展，為基于ICP-MS的單細胞分析研究的進一步展開提供了硬件和方法學保證.

圖13 無油微流控分選-直接注入式單細胞ICP-MS分析平臺[50]Fig.13 Direct infusion ICP-MS of lined-up single-cell using an oil-free passive microfluidic system[50]

圖14 元素標記的病毒樣納米顆粒與細胞 分析信號倍增策略[33]Fig.14 Element-tagged viruslike nanoparticle and signal multiplication strategy for cell analysis[33]

3 總結與展望

從原子到分子和細胞分析方法學經過近20年的不斷發展，使原本以元素分析為目的的原子光譜和ICP-MS拓展至分子乃至細胞、細菌和病毒的檢測.更為重要的是，ICP-MS和所構建的元素標簽工具箱可幫助我們探知尚未了解的生命現象和背后的機制，理解生命過程.一方面，目前所知的金屬和類金屬元素在細胞中的分布和含量信息幾乎都是基于細胞群體分析方法獲得的，單細胞ICP-MS分析可以使我們在單細胞層面上進一步理解關鍵內源金屬和類金屬的生理/病理作用，推動金屬組學研究的發展；另一方面，所發展的化學選擇性和生物特異性元素標記策略可以使我們涉獵以往難以想象的單細胞中超痕量生物分子的檢測，充分發揮ICP-MS直接分析完整細胞的優勢.可以預見，隨著基于ICP-MS生物分析方法的不斷發展，生命元素和分子的功能和細胞的行為將被進一步了解以促進新藥物的設計和研發，疾病的診斷與治療將更加精準，健康的維護將得到進一步提升.

致謝：感謝黃本立先生的教誨！感謝曾經在實驗室工作和學習過的同仁和學生們的辛勤工作！