紅樹植物的胎生現象及其組學研究進展

李慶順，喬紅梅，周曉旋

(廈門大學環境與生態學院，濱海濕地生態系統教育部重點實驗室，福建 廈門 361102)

紅樹林生態系統具有凈化水源、蓄洪抗旱、調節小氣候的作用[1-2]，被稱為防風固堤的衛士[3-5]，為鳥類、海洋動物、微生物等提供了良好的營養環境與繁殖場所[6].紅樹林還具有巨大的經濟價值，在許多發展中國家，依賴于紅樹林的小型水產養殖業以及旅游業都為生活在海邊的居民帶來不菲的經濟收入[7-9]；此外，紅樹林生態系統中還有巨大的碳儲匯[10].

然而，全球氣候變化以及人類活動的干擾給濱海濕地生態系統造成了嚴重的影響，特別是海平面上升和人為砍伐使得在熱帶、亞熱帶濱海濕地生存的紅樹種群數量逐年減少，部分物種甚至處于滅絕的險境[11-16].最新研究顯示，紅樹林移動的速度不足以逃脫海平面上升的影響，到2050年可能會消失[17].人類對土地的過渡使用與富營養化使得紅樹林遭受嚴重的鹽脅迫和多余的營養輸入[14]；海洋污染嚴重威脅著紅樹林的生存，沉積物中原油的濃度是造成紅樹白化的重要原因，紅樹科中4個胎生屬以及白骨壤(Avicenniamarina)的繁殖體都有白化現象發生[18-19]；以犧牲濕地為代價的大量魚塘和蝦塘的修建更是嚴重縮減了紅樹林濕地面積，在我國的許多地方，前有海平面上升，后有堤壩的阻隔，紅樹林處于“進退兩難”的境地.如何拯救這個脆弱的生態系統成為當前亟待解決的問題.

紅樹植物生長在河口潮間帶，長期遭受高鹽、低氧、周期性潮汐的沖刷以及海邊強紫外線的輻射，為此進化出一系列與眾不同的適應性性狀[20-23].胎生作為一種特殊的繁殖方式，是紅樹植物最有趣且最顯著的特征，被認為是紅樹植物為適應濱海濕地環境而進化出的最重要的機制之一，具有重要的生態適應性意義.胎生繁殖體所形成的幼苗(胚軸)是紅樹林恢復造林的優良種子來源，具有易獲取、易操作、易存活等優點，對于解決紅樹林逐年退化的問題具有重要意義.然而，目前對紅樹胎生現象的遺傳與分子機制了解很少，這主要是由于缺乏遺傳與分子資源.近年發展起來的組學技術給這一科學問題提供了新的研究空間.本綜述將從紅樹植物的適應性性狀展開，從組學角度探討紅樹植物胎生現象的研究現狀及發展方向.

1 胎生紅樹研究進展

1.1 胎生現象及其生態意義

植物胎生是一種特殊的種子發育與繁殖方式，是指種子不經過休眠、在母體上直接萌發的現象.目前已報道的胎生植物共25科78種[23].胎生植物大多生長在淺海海灘或潮間帶，而非胎生植物大多生長在陸地或干旱地區，因此普遍認為這是胎生植物在長期適應特殊地理環境條件下所產生的一種獨特的繁殖方式[24].按照萌發過程中胚軸是否突破果皮，可將胎生分為顯胎生(vivipary)和隱胎生(cryptovivipary).顯胎生是指胚胎在母體生長過程中先后突破種皮和果皮的現象，大多發生于紅樹植物以及兩個屬(Amphibolis和Thalassodendron)的海草中[25]，少數發生在陸生種，最顯著的是在紅樹科的紅樹屬(Rhizophora)、秋茄樹屬(Kandelia)、角果木屬(Ceriops)和木欖屬(Bruguiera)；隱胎生是指繁殖體在萌發過程中只突破種皮而不突破果皮的現象，如分布在不同科的海欖雌屬(Avicennia)、蠟燭果屬(Aegiceras)、水椰屬(Nypa)和假紅樹屬(Pelliciera)[23].研究表明，顯胎生與隱胎生在進化上有不同的起源[26].紅樹植物的胎生現象早在100多年前就已被觀察記錄[27]，它的本質是連續的胚胎生長與種子萌發的過程(圖1)，被認為是對濱海濕地環境的適應.

(a)正紅樹(R.apiculata)的未成熟“雙胞胎”，中國海南省三亞市；(b)在水中自定植的美洲大紅樹(R.mangle), 美國大沼澤地國家公園(Everglades National Park),箭頭指示水平面；(c)尖葉秋茄(K.candel), 孟加拉Sundarban；(d)木欖(B.gymnorhiza)，印度尼西亞巴厘島；(e)紅茄苳(R.mucronata)， 印度尼西亞巴厘島；(f)紅茄苳的成熟種子(可達80 cm或更長)，印度尼西亞巴厘島.圖1 幾種顯胎生紅樹植物的繁殖體Fig.1 Propagules of several viviparous mangroves

胎生作為一種植物的繁育機制，關系子代個體存活，與物種的適應能力息息相關，受到強烈的自然選擇；并且這種機制也可決定幼體的定居能力，從而影響紅樹的種群增長和群落構建.紅樹的繁殖體能否順利到達適于其生長的環境并成功定植是紅樹種群世代延續的關鍵.這一過程受到諸多因素的影響：在未離開母體之前繁殖體會遭到如螃蟹、昆蟲等捕食者的捕食；當繁殖體離開母體后會受到自身和環境兩方面的影響，自身的因素包括繁殖體的形狀、大小、密度、休眠周期、死亡率以及根的定植速度等，環境因素包括潮汐的強度、風的大小和方向、水溫、鹽度以及受捕食情況等，這些因素都決定繁殖體能否成功定植[28].

關于紅樹胎生的生態意義有兩種假說：1) 胎生是對高鹽環境的適應.該觀點的提出是基于以下假設，即潮間帶的高鹽環境會嚴重抑制種子的萌發，而胎生種子的下胚軸含有包括水在內的大量營養物質，可供剛定植幼苗的生長所需，故避開了這一脆弱的發育階段[29-31].對絕大多數植物來說，種子休眠是適應陸地環境的重要特征，它們能在種子庫中存活，度過不良環境，等待條件適宜時萌發；然而，對于生活在濱海環境的紅樹植物而言，若種子進行休眠會沒入水底或隨水漂浮，很可能因為環境不適宜而始終無法正常萌發，所以胚胎的提前發育被認為是對高鹽環境的適應，除攜帶營養外，后代可以在母體上對濱海環境因子提前適應.2) 胎生與繁殖體擴散有關.由于環境惡劣，潮間帶地區植物多樣性較低，面臨新的競爭者的機會也較小，繁殖體大多通過水流等非生物因素進行傳播[32-33]，這大大降低了胎生植物向外擴張的機會，因此胎生植物必須就近繁殖來擴大群落以抵御非胎生植物的入侵；而胎生種子在母體上可以完善結構、儲存能量與水分，胚軸迅速生長與成熟，進而有效地應對落地后的復雜環境[34]，可以迅速生根定植，占據潮間帶生態位.

1.2 胎生種子的特點及發育過程

胎生現象是紅樹區別于其他物種最顯著的一個特征.胎生種子具有以下特點，即從種子的形態學結構組成上來說，70%以上的胎生種子在果實中產生，并且種子較大(直徑大于4 cm)，其中在超過74%的種子中胚的占比很大，約為種子體積的1/2，而胚乳特別小或者沒有[35-37].巨大的胚中儲存著豐富的營養物質，而這些營養物質往往來自于母體的供給.在紅樹屬中，與種皮相鄰的最外層胚乳細胞特化出向內皺褶的壁,被稱為轉運細胞；通過轉運細胞,水分和養料得以從種皮向胚轉運, 但隨著胚的不斷生長, 這層轉運細胞被擠壓，最后失去功能.Juncosa等[38]認為這層特殊的轉運細胞與胎生發育有一定的關系，但轉運機制目前尚不清楚.母體與胚胎之間這種獨特的營養運輸方式可能是胎生繁殖方式能夠起源與進化的關鍵原因.

從普通種子發育過程來說，大部分植物的種子從受精到萌發會經過一系列內部的變化：1) 受精后胚不斷長大，胚根和胚芽等組織開始分化；2) 隨著種子的長大，大量營養物質被儲存下來，細胞發生液泡化；3) 種子進行脫水干燥，細胞代謝幾乎停滯；4) 在適宜的環境下，種子開始吸水，代謝活化，營養物質被消耗；5) 胚芽和胚根突破種皮而完成萌發的過程.相比于這些普通種子，胎生種子會跳過第3和第4階段而直接進入最后的萌發過程[35].在紅樹植物胎生發育過程中，部分物種有形態學解剖結構方面較詳細的觀察和描述[38-40].Cook根據美洲大紅樹的發育過程提出顯胎生發育模式分為3個階段[27]：子葉的第一次生長和下胚軸的生長和子葉的第二次生長.紅樹屬、秋茄屬、角果木屬和木欖屬的發育基本都符合這一模式，但在形態上各有特點.早期文獻報道紅樹屬、木欖屬和秋茄屬中均由大量生長的胚乳突破種皮，由于胚乳的劇烈增加，胚孔被迫打開，隨后胚胎開始迅速生長，胚乳被吸收退化；而角果木屬則是依靠胚軸的伸長突破種皮發育的[38].然而周曉旋等[23]發現秋茄(K.obovata)并非依靠胚乳，而是由胚軸的伸長突破種皮完成萌發的，且在受精2周后的種子中沒有發現胚乳，推測在更早期胚乳就已失去作用.可見，胚乳在不同方式的胎生植物中有著不同的作用.

另外，秋茄的種皮和果皮突破處都有明顯的細胞疏松化，這極大地減小了胚軸生長突破的阻力.與休眠種子中種皮和胚乳起抑制萌發的作用不同[41]，紅樹植物的胎生中種皮和胚乳可能有協助和促進萌發的作用.當胚胎突破種皮后，生長動力則來自下胚軸中居間分生組織的細胞分裂[23]，這也與擬南芥(Arabidopsisthaliana)不同，后者靠下胚軸與胚根交界處的細胞分裂和伸長[42].在胚軸突出果皮前后，秋茄的胚根都沒有分化，直到胚軸成熟時才能明顯地觀察到有內生性胚根，幼嫩的根尖外有由薄壁細胞組成的保護結構，初生長時根冠與其外的薄壁細胞連成一體，發育到后期時根冠與薄壁細胞之間出現裂縫.根據陳月琴等[43]的描述，這層薄壁細胞中有單寧，能更好地保護幼嫩的胚根；且此時側根從中柱鞘中發育，在胚軸下部的凸出即為側根的突起，這些側根在胚軸落地后才會伸出，協助胚軸完成直立生長，可以推測無論主根或側根都在掉落前才發育成熟.與非胎生種子發育過程相比，紅樹植物的顯胎生發育存在許多不同，這些結構上的不同很可能與紅樹植物胎生現象適應濱海濕地環境有關，還包含著豐富的植物種子發育多樣性相關知識，有待對其進行深入的機制研究.

2 生態基因組學及其在紅樹胎生研究中的應用

2.1 生態基因組學

物種的DNA序列蘊含了生物體的遺傳信息，基因組測序是解決許多生物學問題的關鍵.基因組學的興起迅速推動了生命科學各研究領域的發展，是揭示物種生物學、遺傳學特性以及物種進化關系最有效、最直接的手段之一.而生態基因組學是一個整合生態學、分子遺傳學和進化基因組學的新興交叉學科，其將基因組學的研究手段和方法引入生態學領域，通過群體基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等方法將個體、種群、群落和生態系統這些不同層次的生態學相互作用整合起來，確定在生態學響應及相互作用中具有重要意義的關鍵基因和遺傳途徑，闡明這些基因和遺傳途徑變異的程度及其進化后的特征，從基因水平探索有機體響應天然環境(包括生物與非生物的環境因子)的遺傳學機制.生態基因組學的研究對象可以分為模式生物與非模式生物兩大類：擬南芥、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等模式生物在生態基因組學領域早期發展發揮了重要作用；隨著基因組學技術的開發與完善，越來越多非模式生物生態基因組學的研究將為生態學的發展提供重要的理論與實踐依據.生態基因組學最核心的方法包括尋找序列變異、研究基因差異表達和分析基因功能等，已廣泛滲透到生態學相關領域中，將會在生物對環境的響應、物種間相互作用、進化生態學、入侵生態學、群落生態學、全球變化生態學等研究領域發揮更大的作用.基因組學方法除能揭示適應性外，對于起源和進化關系方面的研究也展示出其優勢.隨著我國“建設生態文明”戰略的提出，越來越多學者也把目光轉移到一些環保樹木上，對濱海濕地起重要保護作用的紅樹得到重視.通過對紅樹的基因組測序，其起源與進化以及胎生現象等重要適應性特征的相關機制研究取得了重大進展，一些與此相關的基因和通路也相繼被發掘.

2.2 生態基因組學在紅樹胎生研究中的應用

2.2.1 胎生紅樹的起源與進化

胎生現象由Goebel在1905年首次報道[44].然而胎生的起源與進化一直都處于爭議中：Guppy[45]認為胎生是一種原始的性狀，是在一個早期相對穩定的氣候條件下進化而來的；van der Pijl[46]則認為胎生是在某一特定環境下演化而來的.對于包含4個顯胎生屬的紅樹科而言，起源假說也是討論的熱點.分子系統學的研究結果表明紅樹科為單起源[24,26]，即紅樹科植物起源于共同的祖先，但其究竟是起源于陸生祖先還是海生祖先卻不得而知.林鵬等[47]通過比較紅樹科、馬鞭草科和海桑科中部分植物的次生木質部結構，認為紅樹植物演化的過程可能有兩條途徑：1) 紅樹科植物可能起源于陸生祖先，隨后向海陸兩個方向分歧發展.由于海蝕或陸岸下沉，一部分陸生祖先向潮間帶生境拓展，最終演化成為現存的海生紅樹族植物；另一部分祖先則繼續生存在陸地，最終演化為現存胎生紅樹的陸地近緣種一族.2) 紅樹科植物起源于海生祖先，后來由于造陸作用和海蝕作用沿海陸兩條途徑演化.其中一部分登陸，最終演化為陸生紅樹科植物如竹節樹(Caralliabrachiata)等；另一部分由于陸岸下沉向低潮區侵入，演化為潮間帶紅樹一族.顯然，林鵬等[47]認為紅樹科的胎生現象也是起源于特定的氣候條件.

近年來隨著DNA測序技術的發展，越來越多紅樹植物的核全基因組、葉綠體基因組以及線粒體基因組相繼被測序[48-50]，人們開始從組學水平探討胎生紅樹的起源與進化.核基因組已測序的物種中，顯胎生紅樹有紅樹科紅樹屬的正紅樹、紅茄苳、紅海欖(R.stylosa)和美洲大紅樹，木欖屬的木欖(B.gymnorhiza)，秋茄屬的秋茄，角果木屬的角果木(C.tagal)等；隱胎生紅樹有馬鞭草科海欖雌屬的白骨壤(A.marina)；非胎生紅樹有海桑科海桑屬的海桑(Sonneratiacaseolaris)和杯萼海桑(S.alba)，紅樹科竹節樹屬竹節樹(表1).

通過基因組研究發現[51,57]：紅樹科植物在約5 500 萬年前起源于陸生祖先，由于古新世-始新世極熱事件(Paleocene-Eocene thermal maximum,PETM)，全球氣溫升高，極地冰雪融化，海平面上升，淹沒了生長在熱帶雨林邊緣的被子植物，迫使它們適應新的海洋環境；隨后在前4 800萬～5 500萬年間，紅樹科出現分化，此后紅樹科的紅樹屬、秋茄屬、角果木屬及木欖屬與山紅樹屬及竹節樹屬發生進化分歧，前4個屬以顯胎生作為繁殖方式，而后2個屬為非胎生.

紅樹科植物的基因組在發生分歧前都經歷了基因組加倍事件.在進化的過程中基因組發生縮減，導致紅樹的基因組顯著小于陸生木本植物的基因組[64].轉座子含量的減少是引起其基因組減小的關鍵原因[65-66].Lyu等[65]報道，相比于其他29個非紅樹物種，4個真紅樹(即正紅樹、海桑、杯萼海桑和白骨壤)的基因組轉座子含量顯著降低.另有研究表明基因組大小與轉座子活性呈正相關[67-68]，轉座子增殖的速度如果大于其滅亡的速度，那么基因組會隨之越來越大[69-70].紅樹在縮減基因組的過程中，將一些冗余轉座子以及基因家族丟棄，以此來減少整個基因組的負荷，留下那些對植物體生存必要的核心高效基因，這樣植物便可集中全部能量用于對抗高鹽和低氧等逆境脅迫.

2.2.2 胎生分子機制的研究

截至目前，越來越多的研究開始從分子水平對胎生問題進行探索，大多集中在谷類作物和擬南芥突變體中.許多收獲季節的谷類作物在遇到潮濕溫熱的環境時，其種子往往會在植株上萌發，這種現象被稱為“熟前萌發”[71].擬南芥的一些基因突變體也會表現出胎生現象，這些突變體大多是因為基因的缺失，植物激素脫落酸(ABA)合成受阻，或者對ABA不敏感而導致的胎生現象[72].例如玉米(Zeamays)中編碼ABA生物合成第一步反應所需黃質環氧化酶的突變體aba1和ABA不敏感型突變體abi3都表現出胎生現象，水稻(Oryzasativa)中的一些突變體如riv(ricevivipary)1-1、riv1-2和riv2等由于對ABA不敏感也表現出胎生現象[73-74].

表1 紅樹植物的核基因組、葉綠體基因組及轉錄組測序情況Tab.1 List of sequenced mangrove nuclear and chloroplast genomes and transcriptomes

在基因組層面對紅樹胎生機制的研究發現，胎生紅樹在基因組上有使用某些氨基酸的偏好，即氨基酸的替換可能對胎生和其他各種適應性性狀的演化以及對濱海濕地環境的適應具有重要意義[49].同時，Xu等[51]對正紅樹基因組進行分析后發現有19個受到正選擇的基因參與胚胎發育過程，包括在ABA合成與響應、乙烯代謝及響應中有重要作用的基因；另外也發現赤霉素(GA)合成通路中的貝殼杉烯合成酶和GA3β-水解酶編碼基因在基因組上發生隨機加倍事件，且貝殼杉烯合成酶編碼基因有9個拷貝，因此認為該基因的擴張可能與胎生現象有密切關系.Qiao等[57]通過對秋茄、木欖、角果木和竹節樹的基因組測序以及比較分析，發現導致休眠的關鍵基因DOG1在胎生物種中共同缺失，這可能是引起胎生種子不休眠的關鍵原因之一；然而，DOG1調控胎生過程的分子機制還有待研究，很可能是通過調節植物激素ABA與GA的代謝而實現的.

在秋茄的轉錄組研究中發現，胎生過程中內源ABA合成基因表達下調，對ABA響應的基因表達上調，說明胎生繁殖體存在降低ABA水平、減輕抑制發育的機制，以保證胎生的順利發生[56].周曉旋[75]進一步對秋茄繁殖器官胎生的動態過程進行解剖學觀察，發現共有7個關鍵階段，包括：1) 未受精的胚珠；2) 受精2周后的胚珠，萌發出綠色線性胚；3) 胚軸開始分化，但未突破種皮；4) 胚軸突破種皮；5) 胚軸即將突破果皮；6) 胚軸突破果皮；7) 主根和側根開始分化.進而對這7個關鍵階段進行轉錄組測序，發現基因表達在不同的發育階段呈現時空差異，這些差異基因與GA、ABA、生長素、細胞分裂素等植物激素的合成與響應有關[75].Qiao等[57]發現在胚軸突破種皮的關鍵階段，與GA合成相關的關鍵基因KAO的表達顯著上調，負調控響應因子DELLA的表達則下調，導致胎生種子較普通種子而言有更高的GA含量；與此同時，ABA合成的關鍵基因NCED以及響應因子ABF的表達顯著下調，而編碼降解ABA酶的基因CYP707A則在該階段表達顯著上調，其結果是胎生種子與非胎生種子相比具有極低的ABA水平.他們還發現ABA與GA等激素的代謝平衡不同于非胎生種子，特別是低水平的ABA可減輕對萌發的抑制，而高水平的GA使得胚胎持續生長，導致胎生[57].外源噴施實驗證明ABA具有延緩秋茄胎生發育的作用；從紅樹植物中克隆的幾個與ABA響應有關的基因(如ABI1與ABI2)在外源ABA的刺激下，表達水平發生顯著變化[56].

胎生過程的基因組和轉錄組分析還發現，一些種子蛋白的缺失可能與胎生過程的營養供給有關，使得種子必須依附于母體的營養輸送或者胚胎自身的光合作用，才能滿足種子萌發過程對營養的需求，這些關鍵基因的缺失共同影響了胎生的發生[57].對秋茄胚胎發育過程的轉錄組分析發現，一些差異表達基因顯著富集在器官形態建成、光合作用等代謝通路，暗示胎生繁殖器官在發育過程中進行著營養合成，這可能與種子萌發過程的營養供給有關[56].

不僅如此，控制種子休眠的原花青素合成相關基因的表達在種皮中也明顯下調，而該合成通路在非胎生近緣種竹節樹的種子中表達呈現相反的趨勢[57].另有研究發現種皮中原花青素的含量增加能夠有效抑制種子萌發[76].在胎生種子的關鍵部位，原花青素合成驟減為胚胎突破種皮提供了先決條件，但這是原因還是發育的必然結果有待進一步研究.

由上可見，紅樹植物的胎生發育過程存在激素代謝和響應基因的變化，影響了激素合成及下游被調控的基因，從而抑制種子休眠同時促進萌發；而胚胎和種子發育過程中母體的營養供給及萌發的機械屏障減少，都為胎生過程提供了有利的條件，最終使胎生發生.由于紅樹物種遺傳材料的局限性，目前沒有驗證基因功能的轉基因體系，對分子機制研究的手段有所不足，對紅樹的胎生等適應性研究仍停留在初步探索階段.

3 問題與展望

盡管已有很多研究從不同的角度和水平對紅樹胎生進行解釋，但是真正的機制研究還非常有限，仍有許多問題尚不清楚.1) 紅樹胎生過程中的營養供給機制.對于非胎生種子而言，種子在發育的過程中，隨著其逐漸長大，會以種子蛋白的形式儲存大量營養物質，供種子后續萌發[77].但與此不同的是，顯胎生紅樹種子在母體上萌發，那么種子是否有儲存營養物質，還是依靠母體不斷傳送？如果是依靠母體傳送，那么負責傳送的器官或組織是什么？2) 與非胎生紅樹相比，胎生紅樹基因組的特點是什么？3) 直接影響紅樹胎生現象的重要基因有哪些？對于上述這些問題，目前的研究依舊沒有取得突破性進展.一方面是機制研究在木本植物上具有一定局限性，除木本植物培育周期長外，主要是由于沒有遺傳突變體可供研究，也缺乏一個有效的轉基因系統用于驗證基因的功能；另一方面是已全面、深度測序的紅樹物種依然很少，基因組注釋不完整，導致不能進行深層次的機制研究.因此，希望今后的研究中可以有更多的紅樹基因組得到補充，為開展機制研究提供更多的基礎信息.只有更多的胎生紅樹基因組被測序，才能全面地進行基因組比較分析，進而得知胎生紅樹與非胎生紅樹或者其近緣種在基因組上的差異.這些差異基因很可能就是導致胎生現象發生的關鍵，對于研究胎生現象具有極其重要的意義.