中國南瓜突變體庫構建及表型變異的初步分析

閔子揚 韓小霞 李勇奇 胡新軍 汪端華 孫小武

(1湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128；2湖南省農業科學院蔬菜研究所，湖南 長沙 410125)

中國南瓜(Cucurbita moschataD.)是南瓜屬4 個栽培種之一，是葫蘆科(Cucurbitaceae)重要的蔬菜作物，具有廣泛的營養價值、藥用價值和經濟價值[1]。我國關于南瓜的研究以品種選育為主，基礎研究較弱，許多農藝性狀的遺傳規律還不明晰，嚴重制約常規育種發展[2]?；蚪M學的迅速發展可打破常規育種局限，對目標性狀基因的發掘和功能研究已成為基因組學研究的重點[3-4]。正向和反向遺傳學方法對基因組進行分析是功能基因組學研究的兩種有效途徑[5]，而基因變異是基因組分析研究的基礎。構建突變體庫作為獲得基因變異的重要途徑，逐漸受到重視。

構建突變體庫的方法主要包括物理、化學和生物誘變，其中理化誘變能夠高效迅速地獲得更多有價值的突變材料[6]。甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)是目前應用最廣泛的化學誘變劑之一，它可直接誘發點突變，具有操作簡便、高效、突變范圍廣、遺傳穩定等優點，是目前構建突變體庫的首選方法[7]。利用EMS 誘變技術已在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)[8]、水稻(Oryza sativaL.)[9]中構建了飽和突變體庫，并進行了相關基因的功能分析，明確了花期[10]、抗逆性[11-12]及矮化[13]等基因的功能，同時獲得了一批有價值的種質資源。在蔬菜作物方面，目前已在黃瓜(Cucumis sativusL.)[14]、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)matsum et Nakai][15]、甜瓜(Cucumis meloL.)[16]、辣椒(Capsicum annuumL.)[17]、大白菜[Brassica pekinensis(lour).Rupr.][18]等作物上構建了EMS 突變體庫，為相關作物的基礎研究和新品種選育做出了重大貢獻。

2017年南瓜全基因組測序順利完成[19]，使南瓜遺傳育種的相關研究步入后基因組時代，構建南瓜突變體，深入系統研究南瓜相關功能基因勢在必行。然而，目前國內外鮮見南瓜突變體庫構建及相關研究的報道。本研究利用EMS 對中國南瓜高代自交系N87種子進行誘變處理以構建突變體庫，對突變群體的表型變異情況進行篩選與分析，獲得了與株型、花色、葉片、節間長、強雄等性狀相關的突變材料，并進一步明確花色和短蔓突變為單基因隱性突變，以期，為中國南瓜功能基因組研究和新品種選育奠定材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

以中國南瓜高代自交系N87 種子為材料，由湖南省蔬菜研究所南瓜研究室提供。EMS 誘變劑購于美國Sigma 公司，為無色溶液，用0.1 mol·L-1pH 值7.0的磷酸緩沖液稀釋成不同濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 EMS 最佳誘變條件的篩選 將N87 種子在28℃溫水中浸種4 h，28℃催芽12 h，然后在通風櫥中將其浸入50 mL 不同濃度(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%)的EMS 溶液中，以磷酸緩沖液(EMS 濃度為0)浸種為對照；期間，在28℃搖床上分別震蕩10、12、14 h，處理結束后，在通風櫥中將EMS 廢液倒入廢液桶，處理完成的種子在流水下沖洗8 h 后，將種子平鋪于內覆濕潤濾紙的培養皿中，并在28℃培養箱中催芽36 h，催芽結束后統計種子發芽率及發芽勢，然后將種子播種于穴盤，7 d 后統計各處理的成苗率及植株苗期生長情況，綜合評估以確定中國南瓜種子EMS 誘變的最佳處理條件。以上每處理100 粒種子，重復3 次。

1.2.2 中國南瓜突變體庫的構建 2018年春季，將10 000 粒飽滿、大小均一的中國南瓜N87 的種子采用篩選的最佳誘變條件進行誘變處理，將處理后發芽的種子播種至穴盤內進行育苗。4月中旬定植于湖南省蔬菜研究所高橋科研基地，共成活3 960 個單株，構成中國南瓜突變體庫M1群體；正常田間管理，嚴格自交授粉，共收獲725 份單株自交瓜種子，每份種子記為1個M2株系。2018年秋季，從M2中隨機選取98 個株系在海南三亞南濱農場進行種植，每株系定植16 株(不足16 株按實際株數種植)，共計1 432 個單株，構成中國南瓜突變體庫M2群體，正常田間管理。

參照農業農村部中國南瓜DUS(特異性、一致性和穩定性)測試指南[20]，以野生型中國南瓜N87 為對照，分別觀察M1、M2變異群體的形態特征，記錄變異群體的葉色、葉形、葉片大小、株形、花色、瓜形、性別等性狀。M2中發現的變異材料自交留種的同時與野生型雜交以構建分離群體，對相關變異性狀進行遺傳分析。

2 結果與分析

2.1 中國南瓜種子EMS 最佳誘變條件的篩選

由表1可知，EMS 濃度為0.8%時，種子的發芽率與對照相比有所提高，推測低濃度的EMS 能促進中國南瓜種子的發芽。在EMS 濃度大于0.8%時，隨著誘變時間和EMS 濃度的增加，種子的發芽率和成苗率均呈現下降的趨勢，表明EMS 誘變能夠導致中國南瓜種子的死亡。在1.6% EMS 濃度下處理12 h 時，種子的發芽率為59%，芽勢較弱，成苗率為65%，幼苗生長緩慢、真葉皺縮，綜合成苗率為38.40%(圖1-A、B、C、D)，在發芽率接近半致死的同時還可保證一定的成苗率；磷酸緩沖液處理12 h 后表現為發芽率93%，芽勢強，成苗率93%，苗期生長旺盛、真葉平展(圖1-a、b、c、d)。綜上確定1.6% EMS 處理12 h 是中國南瓜種子最佳的誘變處理條件。

表1 不同濃度EMS 和處理時間對中國南瓜種子發芽率和成苗率的影響Table 1 Effects of concentration of EMS and treatment time on germination and survival rate of pumpkin seeds

2.2 中國南瓜突變體庫M1 群體的表型變異分析

2018年春季，將1.6% EMS 處理12 h 后發芽的種子播種至穴盤內進行育苗，最終田間成活3 960 個單株，構成中國南瓜突變體庫M1群體。M1群體中出現了很多表型變異，但這些變異很多是化學藥害造成的，屬不可遺傳的變異，因此本研究對M1群體只進行觀測而未進行篩選。M1群體正常田間管理，嚴格自交授粉，由于EMS 處理后的很多植株表現出葉片黃化、白化、葉片皺縮、植株簇生、雌花畸形、花粉敗育、花期不遇等情況，自交授粉率低，M1群體只收獲725 個單株自交瓜種子，記為M2。

2.3 M2 群體田間性狀調查及部分突變性狀分析

2018年秋季在三亞南濱農場種植M2的98 個家系，每個家系種植16 株，部分單株不足16 株，共計1 432 個單株，自交留種，同時把突變體與野生型進行雜交。調查發現，M2突變材料中總體表型突變頻率為11.20%，主要包括葉色、葉形、葉片大小、花色、花期、雌花節位、單性結實、株型、蔓長、果形等變異(表2)。

2.3.1 M2群體真葉突變表型變異分析 野生型中國南瓜材料N87 的真葉近掌狀，邊緣缺裂中等，上覆白斑，葉色深綠(圖2-A)。M2群體中的真葉變異主要表現在葉形和葉色兩方面，其中葉形有葉片小而尖、葉色淡綠(圖2-B)；葉片近圓形(圖2-C)；葉緣細鋸齒狀且內卷(圖2-D)；葉片小而皺縮、缺刻極深、葉色濃綠(圖2-E)等突變材料出現；葉色方面，出現了葉色淡綠(圖2-F)；全白色(圖2-G)；淺黃色上覆白斑(圖2-H)；深黃色(圖2-Ⅰ)；淺黃色與綠色不規則嵌合(圖2-J)；淺黃色與綠色規則嵌合(圖2-K)；生長點黃化后逐漸又轉為綠色等突變材料(圖2-L)。葉片變異是在M2群體中突變頻率較高的一種類型，其突變頻率為4.55%，占總突變頻率的40.63%。

2.3.2 M2群體株型突變表型變異分析 野生型南瓜N87 屬中國南瓜類型，主蔓長約3.5 m，葉片長約28 cm、寬約26 cm，上被白斑、葉色深綠，主生長點明顯，主蔓節間長約23 cm(圖3-A)。M2群體中株型突變主要表現為植株生長瘦弱、葉片變小(圖3-B)；植株葉片生長緊湊、葉柄與主蔓夾角變小(圖3-C)；植株葉片淺綠、主蔓無法正常伸長(圖3-D)；葉片皺縮無法正常展開、植株呈雞爪狀(圖3-E)；植株簇生無生長點(圖3-F)；花打頂(圖3-G)；植株節間長變短、呈半蔓生狀(圖3-H)。株型變異頻率僅次于葉片變異頻率，其突變頻率為2.31%，占總突變頻率的20.63%。

表2 中國南瓜突變體庫M2 群體表型變異情況Table 2 Statistic of mutant type of M2 generation in pumpkin mutation library

2.3.3 M2群體生殖器官突變表型變異分析 野生型南瓜花冠顏色為橙黃色(圖4-A)，雄花柱頭細長、上被花粉，雌花花冠能夠正常打開、子房大小正常。M2生殖器官變異主要表現為花冠顏色變淺、呈白色(圖4-B)；雄花柱頭短縮、無花粉(圖4-C)；雌花花冠不能正常打開、子房變態膨大、可單性結實等現象(圖4-D)。生殖器官變異在M2群體中突變頻率為2.10%，占總突變頻率的18.80%。

2.3.4 M2群體果實突變表型變異分析 野生型中國南瓜N87 為高代自交系，其果實長紡錘形、果長約24 cm、寬約20 cm、無明顯果柄、淺棱、成熟果深黃色、上覆蠟粉、一致性好(圖5-A)。M2群體中出現了很多果型變異的情況，主要表現為果長變短呈扁圓形(圖5-B)；高圓形(圖5-C)；正圓形(圖5-D)；果長與野生型基本一致、但果實變粗呈近高圓形(圖5-E)；果柄和底部收窄變尖(圖5-F)；果長變長呈長圓筒形(圖5-G)；有瓜把和種腔膨大(圖5-H)。果型變異在M2群體中突變頻率為2.24%，占總突變頻率的20%。

2.4 花色與短蔓突變性狀的觀測與遺傳分析

M2群體中很多具有突變性狀的植株，無法收獲自交種子，導致無法進行突變性狀的M3驗證。目前已通過M3和F2分離群體驗證，明確為穩定可遺傳變異的有白花突變(圖6-B)和短蔓突變(圖6-D)，卡方測驗結果表明(表3)，這2 個性狀F2的分離比均符合3∶1，為單基因隱性突變。

表3 2 個突變性狀的卡方值計算表Table 3 Two mutants χ2 worksheet

3 討論

3.1 誘變條件與建立高效突變體庫

EMS 誘變技術廣泛應用于作物突變體庫的構建，目前已在水稻[20]、大豆[21]、玉米[22]、番茄[23]、甘藍[24]、黃瓜[25]等作物上成功構建突變體庫，并在功能基因組學研究上發揮了巨大作用。作物EMS 誘變過程中，尋找半致死劑量(LD50)是關鍵的步驟[26]，對突變體庫的高效構建至關重要，但由于作物種類、品種甚至是誘變部位的不同，EMS 誘變的最佳處理濃度和時間差別較大。黃萍等[27]以馬鈴薯愈傷組織為材料，確定0.8% EMS 處理4 h 可達到較好的半致死效果。盧銀等[18]以大白菜種子為材料，確定0.4% EMS 誘變處理16 h 為大白菜種子EMS 誘變的半致死劑量。張兵[28]用LD50為指標確定山農5 號黃瓜的EMS 最佳誘變條件為1% EMS 處理22 h。本試驗以中國南瓜高代自交系種子為材料，以半致死率為最佳誘變條件的篩選標準，發現中國南瓜種子用1.6% EMS 處理12 h時，其發芽率為59%，成苗率為65%，M2總體表型突變頻率達11.20%，利用此方法進行中國南瓜突變體庫的構建，既可產生較高的突變頻率，又可保障突變體庫具有一定的規模。

3.2 中國南瓜突變體庫M2 表型變異調查與固定

本研究利用1.6% EMS 處理10 000 粒中國南瓜種子12 h 時，獲得了由3 960 個單株組成的M1群體，對M1群體進行全生育期觀察發現，該群體在苗期存在發芽緩慢、真葉皺縮，葉片黃化、白化、葉色嵌合，葉片細小或無法正常展開、植株矮小，生殖器官退化等變異現象，這與前人的研究結論一致[28-29]。由于M1中很多變異是化學藥害造成的假突變，因此無需對M1進行選擇，但有必要進行觀測，一方面可以通過M1的變異情況評估誘變效果，另一方面為M2突變材料的篩選提供必要指導。M1代全部自交留種，共收獲725個單株自交瓜種子，記為M2。

每份M2種子記為一個家系，每家系種植16 株進行表型變異的觀察，由于南瓜種植所需面積大且需單株自交授粉，目前本試驗只對98 個家系進行了觀測，發現M2總突變頻率達11.20%，在株形、葉片大小、果形、花色等方面獲得了一批穩定遺傳的突變材料。本試驗仍剩余627 個家系未進行篩選，基于已篩選家系的突變頻率推測，預期將獲得很多突變材料，可為下一步進行相關基礎研究及新品種選育提供材料研究基礎。

3.3 突變性狀的遺傳分析是突變體進一步研究利用的基礎

EMS 誘變是非定向的，產生的突變材料在育種上是否有應用價值需要在生產實踐中進一步檢驗，但這些突變材料在相關基礎研究中意義重大，對突變性狀進行遺傳分析是進行相關基礎研究的前提。M1中出現了很多葉色嵌合、葉片形態變化、生殖器官退化等表型，但是這些表型在其M2株系中大部分恢復正常，這與前人的研究結論一致[30]。一般情況下，EMS 導致的點突變往往導致基因的失活，假如突變位點為表型相關基因，則在M2株系中會出現突變的隱性表型[31]。本試驗在M2中發現很多表型突變材料，經M3驗證能夠穩定遺傳的有以下幾種:花色突變材料，該材料可作為標記性狀應用于南瓜的雜交制種過程、開發新型制種模式；短蔓突變材料節間長變短、半蔓生，株形緊湊，是培育短蔓品種的理想材料；強雄與單性結實突變材料，強雄材料45 節內無雌花、單性結實突變材料雌花花冠無法正常打開但可正常坐果，這兩個材料對研究南瓜性別意義重大。本研究后續將從這些性狀的基因定位等方面開展工作，進而提高中國南瓜的基礎研究水平。

本研究突變體庫數量較大且南瓜突變體篩選相對困難，在突變性狀的鑒定中，本試驗只對表型變異進行了鑒定，而其他一些與育種關系密切的性狀，如果實淀粉含量、纖維素含量、抗逆性等未進行篩選，下一步將加強這些方面的篩選工作，同時做好已獲得突變材料的基礎研究爭取獲得更多能夠應用于育種實踐的突變材料。

4 結論

本研究確定了中國南瓜高代自交系N87 種子EMS 誘變的最佳條件為1.6% EMS 處理12 h，該處理下種子發芽率為59%。構建了由725 個M2家系組成的中國南瓜突變體庫，M2總體表型突變頻率達11.20%。通過該突變體庫篩選到了一些能夠穩定遺傳的突變材料，其中花色突變材料、短蔓突變材料、單性結實突變材料、強雄突變材料有望在南瓜輕簡化栽培上發揮重要作用。另外，本研究確定了花色突變和短蔓突變為單基因隱性突變所致，相關基因的定位工作正穩步推進。