小麥背景中披堿草部分染色體的FISH鑒定

宮文萍 汪曉璐 韓 冉 李光蓉 李豪圣 劉建軍 劉 成 楊足君

(1山東省農業科學院作物研究所/農業農村部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2電子科技大學生命科學與技術學院，四川 成都 610054)

小麥(Triticum aestivumL.)是世界上重要的糧食作物之一，但白粉病和銹病等病害嚴重影響小麥生產[1-2]。小麥近緣物種中含有豐富的抗病基因，是小麥育種的優異基因源。將小麥近緣物種含有的抗病基因導入小麥，是改良栽培小麥抗性的有效方法[2]。披堿草屬是Carl Linne 于1753年建立的一個老屬，含有83 個種、20 個變種和一些稱為變型的分類群，共含約150 種多年生植物[3-4]，廣泛分布于歐洲、亞洲、南北美洲、澳洲和新西蘭等溫帶、熱帶、亞熱帶以及北極地區[5]，是小麥族中最大、分布最廣的屬。粗穗披堿草[原名纖毛鵝觀草(Roegneria ciliaris)，科學家也稱其為Elymus trachycaulus，基因組StStHtHt，2n=4x=28]和纖毛披堿草(Elymus ciliaris，基因組ScScYcYc，2n=4x=28)是披堿草屬的兩個種，分別于1966 和1968年被研究者發現[6-7]。

粗穗披堿草高抗小麥條銹病[8]、葉銹病[8-11]、稈銹病[8，12]、白粉病[8-10]、大麥黃矮病[8-12]和梭條花葉病[8，10，12]等病害，可用于土壤生態改良[13]，并作為基因資源改良大麥[14]。在小麥與粗穗披堿草遠緣雜交研究方面，Smith 早在1942年就開始了將該種質向小麥導入的工作[15]，但是之后的報道稱導入未獲得成功[16]。其后，Sharma[17]利用胚拯救技術開展了將粗穗披堿草導入小麥的工作，獲得了一批雜交后代材料。Morris 等[12]、Gill 等[8]和Jiang 等[18]分別從這批雜交后代材料中篩選并鑒定出了小麥-粗穗披堿草染色體附加系、代換系、易位系和端體系等材料。

纖毛披堿草高抗小麥葉銹病[19]、稈銹病[19]、赤霉病[20]、小麥條紋花葉病[19]和大麥黃矮病[19，22]等病害。在小麥與纖毛披堿草遠緣雜交研究方面，劉大均院士課題組于19世紀80年代開展了該種質向小麥導入工作[20]。其后，多個研究團隊先后從小麥-纖毛披堿草交后代材料中篩選并鑒定出了小麥-纖毛披堿草染色體附加系或易位系等材料，并且其中部分材料的赤霉病或黃矮病抗性良好[21-26]。

雖然小麥-粗穗披堿草[8，11，17-18]和小麥-纖毛披堿草[20-26]種質已經被創制出來，然而，已建立的能夠快速鑒定小麥背景中粗穗披堿草和纖毛披堿草的分子和細胞學方法還非常有限。以寡聚核苷酸OligopSc119.2-1 和Oligo-pTa-535-1 為探針的雙色熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)結合以寡聚核苷酸(GAA)8為探針的單色FISH，既可以有效快速鑒定小麥染色體[27]，又可以鑒定小麥背景中的單芒山羊草[28]、頂芒山羊草[29]和無芒山羊草[30]等物種染色體。然而，上述3 個探針結合鑒定小麥背景中粗穗披堿草或纖毛披堿草染色體的報道尚鮮見。本研究用上述3 個探針順序FISH 對小麥-粗穗披堿草附加系和小麥-纖毛披堿草附加系進行分析，擬建立能用于鑒定小麥2 種披堿草染色體的標準核型，提供檢測小麥2 種披堿草染色體的細胞學方法，為鑒定小麥染色體的結構變異奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料均由美國堪薩斯州大學小麥遺傳資源中心的Bernd Friebe 教授惠贈(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 根尖采集 將供試材料種子放于鋪有打濕濾紙的培養皿中，置于22～24℃的恒溫光照培養箱中，培養約24 h。待種子萌動后，將培養皿轉到4℃冰箱處理24 h。然后，轉入22～24℃恒溫光照箱培養24～35 h，待根尖長至1～1.5 cm 時采集根尖，冰水混合物處理24 h，卡諾固定液Ⅰ(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定3～7 d，放入4℃冰箱備用。

1.2.2 根尖處理與染色體制片 將備用根尖的分生組織切下，放入含2%果膠酶R-10(日本Yakult 公司)和2%纖維素酶Y-23(日本Yakult 公司)的10 μL 混合酶液中，37℃水浴50 min 酶解。酶解后，用70%酒精沖洗2 次，用解剖針將根尖分生組織搗碎，低速(2 000 r·min1) 離心10 s，倒掉酒精，加入100%乙酸20 μL，渦旋混勻；取7 μL 根尖分生組織細胞懸浮液，滴到載玻片上，約5 min 待乙酸完全揮發后鏡檢，鏡檢合格的染色體制片置于-20℃冰柜中備用。

表1 供試材料Table 1 The materials used in the research

1.2.3 熒光原位雜交 取濃度約為10 μmol·L-1的探針0.2 μL(雙色FISH 兩探針各加0.2 μL)加入到8 μL 2×檸檬酸鈉鹽(saline sodium citrate SSC)(pH 值7)溶液中，渦旋混勻配成雜交液。將雜交液滴至制備好的玻片上，蓋上蓋玻片，置于濕潤的塑料盒中80℃變性5 min，然后將塑料盒置于37℃雜交箱中，雜交5 h。取出染色體制片，放于2×SSC 溶液的洗脫缸中，洗掉蓋玻片和雜交液，然后再用ddH2O 沖洗一遍，晾干，避光滴加一滴抗褪色劑(propidium iodide，PI)，蓋上蓋玻片用OLYMPUS BX53 熒光顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]鏡檢，DP70CCD 鏡頭下拍照。

雜交過一次的染色體制片進行二次FISH 前，需用95%的乙醇泡玻片5～10 min，將FISH 信號洗脫掉，然后再用卡諾固定液Ⅰ固定1 h，晾干后可再次FISH。試驗所用探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1 和(GAA)8序列參見文獻[27-28]，由成都瑞信生物公司合成。

2 結果與分析

2.1 小麥-粗穗披堿草附加系FISH 分析

利用探針Oligo-pSc119.2-1 和Oligo-pTa-535-1對中國春-粗穗披堿草1St附加系、5Ht附加系、6Ht附加系和7Ht附加系進行FISH 分析，然后洗掉探針雜交信號，再利用探針(GAA)8進行順序FISH，結果發現，上述探針結合使用可以有效鑒別全部小麥染色體和外源染色體(圖1-A、C、E)，其中，5Ht附加系FISH 圖如圖1-A 和1-B 所示，其2n=44，1 對粗穗披堿草5Ht染色體的著絲粒區、短臂中部和末端、長臂端部和亞端部覆蓋有很強的Oligo-pTa535-1 信號，整條染染色體無Oligo-pSc119.2-1 信號(圖1-A、圖2)。此外，該染色體長臂近著絲粒處有較強的(GAA)8信號(圖1-B、圖2)。另外發現一條2B 染色體的短臂末端易位到4A 短臂上，形成2BS-4AS·4AL 易位染色體，該條短臂末端發生結構變異的2B 染色體標記為2B-del(圖1-A、圖3)，而另一條2B 和4A 為完整染色體(圖1-A)，未發生染色體重排。

順序FISH 對中國春-粗穗披堿草1St附加系分析發現，該附加系自交后自發變成了中國春-粗穗披堿草染色體代換系(2n=42)，其中小麥1BL 和3BS 染色體臂發生重組形成一對3BS·1BL 易位系(圖3)，而染色體臂3BL 和1BS 丟失，因此，該材料是中國春-粗穗披堿草1St(1BS·3BL)代換系。Oligo-pTa-535-1 雜交信號僅分布于1St短臂近端部和近著絲粒區域，而1St長臂上沒有雙色FISH 信號(圖2-A)。(GAA)8在1St染色體著絲粒處、短臂近著絲粒處有很強的雜交信號，在長臂近著絲粒處有弱(GAA)8信號(圖2-B)。同時，相比對照中國春，該材料有一對5A 染色體短臂端部Oligo-pSc119.2-1 信號丟失(圖3)，即OligopSc119.2-1 序列發生了刪除，該染色體記為5A-del。

順序FISH 對中國春-粗穗披堿草6Ht附加系分析顯示，其2n=44，一對6Ht染色體在除了長臂端部和近著絲粒區外的位置幾乎全被Oligo-pTa-535-1 信號覆蓋；短臂亞端部和短臂中部有Oligo-pSc119.2-1 信號(圖2-A)。6Ht染色體短臂亞端部、長臂近著絲粒區和長臂中部具有較強(GAA)8信號(圖2-B)。該附加系中的小麥染色體Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1 和(GAA)8雜交信號與中國春相同，未發現小麥染色體結構變異情況。

順序FISH 對中國春-粗穗披堿草7Ht附加系分析顯示，其2n=44，一對7Ht染色體短臂末端具有較強的Oligo-pSc119.2-1 信號，其短臂亞端部和短臂中部、長臂近著絲粒區、長臂亞端部和端部均有Oligo-pTa-535-1 信號，信號幾乎完全覆蓋整條染色體(圖2-A)。7Ht染色體短臂近末端、短臂中部、短臂和長臂近著絲粒區、長臂中部均有較強(GAA)8信號(圖2-B)。該附加系中的小麥染色體Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1 和(GAA)8雜交信號與中國春相同，未發現小麥染色體結構變異情況。

2.2 小麥-纖毛披堿草附加系FISH 分析

順序FISH 對小麥-纖毛披堿草1Sc附加系、3Sc附加系、1Yc附加系、5Yc附加系和7Yc附加系進行分析發現，除3Sc附加系2n=42＋2t(t=telosomics，端體)外，其余4 份附加系2n=44；與中國春相比，5 份附加系中的小麥染色體均未見染色體結構變異情況，外源染色體的FISH 信號較少且信號強度較弱(圖1-C～F，圖2)。其中，1Sc短臂末端具有微弱的Oligo-pSc119.2-1 雜交信號(圖2-A)，短臂近著絲粒處有微弱的(GAA)8雜交信號(圖2-B)。3Sc附加系中發現1 對端體，沒有任何雜交信號(圖2)，因該附加系的42 條小麥染色體是完整的，所以這對端體應該是3Sc染色體長臂或短臂。1Yc染色體短臂末端和著絲粒處具有微弱的Oligo-pSc119.2-1 信號(圖1-C、圖2-A)，著絲粒處具有較弱的(GAA)8雜交信號(圖1-D、圖-2B)。5Yc染色體短臂近著絲粒處具有Oligo-pSc119.2-1 信號(圖1-E、圖2-A)，長臂近著絲粒處具有弱(GAA)8信號(圖1-F、圖2-B)。7Yc染色體短臂末端具有較強的Oligo-pSc119.2-1 信號、長臂末端具有弱OligopSc119.2-1 信號，其短臂和長臂近末端以及著絲粒處具有弱Oligo-pTa-535-1 信號(圖2-A)，著絲粒處即短臂近著絲粒處具有微弱的(GAA)8信號(圖2-B)。

3 討論

物種染色體特異標記是鑒定小麥遠緣雜交種質的重要工具。在粗穗披堿草和纖毛披堿草染色體特異標記建立方面，Morris 等[31]建立了染色體標準C 帶和N帶；Gill 等[8]建立了染色體特異限制性內切酶片長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)標記；Jiang 等[18-19]建立了生化標記并獲得了檢測粗穗披堿草St基因組的特異探針。此外，Kay 等[32]建立了粗穗披堿草蛋白質標記和形態學標記；宮文萍等[9]建立了粗穗披堿草1Ht染色體特異酶切擴增多態性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)標記。陶文靜等[23]建立了纖毛披堿草染色體特異RFLP 標記；孔令娜等[25]建立了纖毛披堿草染色體1、2 和6 同源群分子標記；韓冉等[33]建立了粗穗披堿草1Yc染色體特異PLUG 標記。然而，N 帶、C 帶、RFLP 標記操作費時費力，單個生化標記或分子標記僅能對小麥中單條披堿草染色體進行檢測。本研究利用寡聚核苷酸為探針，建立了粗穗披堿草部分染色體標準FISH 核型，為小麥背景中粗穗披堿草1St、5Ht、6Ht和7Ht染色體鑒定跟蹤提供了新的檢測方法。然而，纖毛披堿草FISH 信號太弱，較難用于小麥-纖毛披堿草染色體重組體的鑒定，在今后的研究中應加強其染色體特異分子標記的開發與利用。

包括雙二倍體/部分雙二倍體、附加系和代換系等在內的小麥-遠緣物種染色體系的鑒定保存是小麥種質資源學的重要研究內容之一[10，30，33-34]。由于種質資源數量多或鑒定條件限制，研究種質資源的人員對這些材料的繁殖往往通過種植-揚花前套袋-自交-收種保存等步驟進行。然而，本研究前期在利用FISH 對小麥-單芒山羊草1N～7N 附加系進行檢測時發現，4N附加系部分單株自發形成了4N(4B)易位系[34]；對小麥-希爾斯山羊草1Ss～7Ss附加系進行FISH 檢測時，發現1Ss附加系和4Ss附加系部分單株自發形成了1Ss(1B)代換系和4Ss(1D)代換系(結果未發表)。Garg 等[35]發現小麥-長穗偃麥草1E 附加系可自發形成1E(1D)代換系。本研究發現小麥-粗穗披堿草1St附加系已經自發形成了1St(1BS·3BL)代換系。上述現象表明，部分小麥-遠緣物種附加系細胞學并不穩定，因此，繁種前后應對材料進行單株細胞學鑒定。上述現象不能簡單解釋為小麥花粉污染造成，因為附加系提供配子是21′＋1′，飛花小麥提供配子為21′，其雜交后代只能有21″、21″＋1′或21″＋1″三種情況，無法自然產生20″＋1″即代換系。因此，附加系自發形成代換系的機制，以及形成代換系的染色體偏好性等問題都還有待進一步研究。

染色體重排是物種進化的重要動力[35]，這種重排可能是染色體缺失、易位、環染色體、雙著絲粒染色體和臂間內倒位等[36-38]。在小麥族中，染色體重排現象并非個例。目前，已有研究報道在一粒小麥[39]、烏拉爾圖小麥[40]、粗穗披堿草[18-19]、冰草[41]、單芒山羊草[28]、小傘山羊草[42]、偏凸山羊草[43]、頂芒山羊草[44]、尾狀山羊草[45]、簇毛麥[46]和黑麥[47]等物種中均發現了染色體重排現象。本研究在小麥-披堿草附加系/代換系中不僅發現3BS·1BL 和2BS-4AS·4AL易位(圖3)，還發現了染色體3BL 和1BS 丟失、2BS 和5AS 端部丟失(圖3)等現象。這些染色體結構變異，可以解釋為物種適應環境或為達到細胞學穩定性最佳狀態的自我調節，然而，這種染色體重排造成的基因順序重排、基因鄰接的功能、重排后基因轉錄表達水平等問題仍有待進一步深入研究。

4 結論

本研究利用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1 和Oligo-pTa-535-1 為探針的雙色FISH 和以(GAA)8為探針的單色FISH 建立了粗穗披堿草1St、5Ht、6Ht、7Ht染色體標準FISH 核型，確定了檢測小麥背景中粗穗披堿草染色體的跟蹤鑒定方法，獲得了小麥-粗穗披堿草1St(1BS·3BL)代換系及5A-del 和2BS-4AS·4AL 等染色體結構變異體，為研究染色體結構變異與表型關聯分析提供了研究基礎。然而，纖毛披堿草FISH 信號太弱，需在今后的研究中加強其基因組特異FISH 新探針及其染色體特異分子標記的開發。