百香果低溫脅迫轉錄組及茉莉酸代謝基因分析

韋曉霞 王小安 陳 瑾 賴瑞聯 吳如健

(福建省農業科學院果樹研究所，福建福州 350013)

百香果(Passiflora eduliaSims)也稱雞蛋果、紫果西番蓮、黃果西番蓮，廣泛種植于我國熱帶與亞熱帶地區，其果實多汁、香氣濃郁，且富含類黃酮、生物堿等生物活性成分，是一種廣受歡迎的水果[1]。此外，百香果花大而獨特，多樣性豐富，具備較好的觀賞價值。因此，百香果是一種兼具食用、藥用與觀賞價值的藤本果類，具有較高的研究開發價值。百香果種植于高緯度或高海拔地區易遭受低溫凍害，即使在現有主產區，也常受到異常極端低溫天氣的危害。低溫凍害已成為百香果產業面臨的重要限制因子，影響其產業的可持續發展和輻射推廣。然而，目前百香果的研究主要集中在引種、栽培、果實品質以及采后加工等方面[1-3]，在抗寒和低溫脅迫方面的研究較少[4-6]。在已有報道中，陳穎等[7]研究了百香果在低溫脅迫下生理生化及顯微結構變化，認為低溫預冷是提高其抗凍性的有效措施之一；董萬鵬等[6]研究發現在一定溫度范圍內隨著處理溫度的下降，百香果枝條中相對電導率、可溶性糖及脯氨酸含量呈上升的趨勢，抗寒性較好的葉片柵/海比例較高、組織結構較為緊密以及具有更大的葉脈突起且葉脈厚而葉片薄的結構特點。然而，關于百香果低溫脅迫響應或抗寒機理方面的研究較少，一定程度上影響了生物技術手段在百香果育種和產業中的應用。

低溫寒害是熱帶亞熱帶作物產業中普遍存在的自然限制因子。研究表明，植物受到冷脅迫后，能夠誘導一系列的信號轉導，啟動或抑制相關基因的表達，從而改變細胞膜特性、調節氣孔開閉以及調控脯氨酸等物質的合成與降解等，進而提高植物的抗寒能力[8-10]。水稻細胞膜上的低溫感受器能夠在感知低溫刺激后觸發鈣信號產生，進而對鈣/鈣調素調控類受體激酶(calcium/calmodulin-regulated receptor-like kinase，CRLKs)、鈣依賴性蛋白激酶(Ca2＋-dependent protein kinases，CPKs)、鈣調磷酸酶B 類蛋白(calcineurin Blike protein，CBLs)、鈣調磷酸酶B 類蛋白激酶(CBLinteracting protein kinase，CIPKs)的表達水平產生影響，然后通過ICE1(inducer of CBF expression1) 或CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)等轉錄因子影響相關基因表達[11]；植物中SnRK2s(sucrose non-fermenting-related protein kinase 2s)在收到低溫信號后可通過直接調控ICE1 或間接調控HOS1(high expression of osmotically responsive genes 1)轉錄[12]，ICE1 再通過CBFs(C-repeat-binding factors)調控下游COR(cold-regulated gene)的表達水平，從而響應低溫脅迫[13]。此外，MYBs(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog transcription factors)、WRKYs(WRKYtype transcription factors) 及ZATs(zinc finger protein transcription factors)等轉錄因子家族在植物抗寒或低溫脅迫響應過程中也發揮了重要作用[14]。

茉莉酸(jasmonic acid，JA)是植物體內非常重要的一類激素。在香蕉(Musa nanaLour.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、菠菜(Spinacia oleraceaL.)[17]及甜瓜(Cucumis meloL.)[18]等植物上的研究表明，茉莉酸類物質可以提高植物對冷脅迫的抗性，且能夠與脫落酸(abscisic acid，ABA)代謝途徑相互影響[19]。植物茉莉酸代謝過程較為明確，其中丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase，AOS)與丙二烯氧化物環化酶(allene oxide cyclase，AOC)調控茉莉酸類物質生物合成[20-24]，茉莉酸氨基合酶(jasmonate resistant 1，JAR1)參與茉莉酸代謝的信號傳遞[25]，茉莉酸信號受體蛋白(coronatine-insensitive protein 1，COI1)參與茉莉酸介導的防御響應[26]，JAZ 蛋白(jasmonate ZIM-domain)參與茉莉酸信號傳遞且與MYB、AOC 及MYC2 存在互作關系[27-32]，MYC2 轉錄因子(transcription factor MYC2)是茉莉酸信號傳遞的核心轉錄因子，且可與COI1 及JAZ形成復合體作為茉莉酸信號的核心模塊[33]，同時MYC2在ABA 信號轉導途徑中可能通過ABA 受體類蛋白PYL (pyrabactin resistance like )/PYR (pyrabactin resistance)建立聯系[34]。目前，百香果低溫脅迫下JA代謝途徑在其中的響應方式鮮見報道。因此，本研究以紫果百香果為材料，開展百香果低溫脅迫轉錄組研究，并從中挖掘JA 代謝途徑相關的差異表達基因，以期為進一步研究百香果抗寒機制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用同一株生長正常的百香果植株剪取枝條進行扦插，同一水平下進行管理，選擇生長相對一致、苗高約為60 cm 的扦插苗為試驗材料，分別進行低溫脅迫處理(LT，0℃處理24 h)和常溫處理(CK，25℃處理24 h)。每個處理進行3 次生物學重復。處理后采集頂端向下第3 和第4 片葉片液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存備用。

多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(離心柱型)，北京全式金生物技術有限公司；mRNA 富集用的磁珠mRNA Capture BeadsRNA，南京諾唯贊生物科技有限公司；文庫構建試劑盒NEBNext? UltraTMRNA Library Prep Kit，美國New England Biolabs 公司；逆轉錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel)，北京全式金生物技術有限公司；實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 試劑盒TransStart? Top Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Eppendorf 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；2720 PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Vortex-Genie 2 漩渦震蕩器，北京中西遠大科技有限公司；BE-1100 四維旋轉儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Illumina HiSeq X-Ten 高通量測序儀，美國Illumina 公司；Eppendorf Realplex4熒光定量PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 轉錄組文庫構建和數據組裝 提取樣品總RNA，去除核糖體RNA 后分離純化mRNA 樣品檢測合格后，基于Illumina HiSeq X Ten 測序平臺，構建百香果轉錄組文庫。使用Illumina Hiseq 高通量測序平臺對cDNA 文庫進行測序。對獲得的數據進行質量檢測，截除Reads 中的測序接頭以及引物序列并過濾低質量值數據，最終獲得高質量Reads。

1.3.2 基因表豐度檢測與差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 采用Bowtie 將測序得到的Reads 與Unigene 庫進行比對，根據比對結果，結合RSEM 進行表達量水平估計。利用FPKM(fragments per kilobase per million reads)值表示對應Unigene 的表達豐度。隨后，采用DESeq2 進行樣品組間的差異表達分析，采用Benjamini-Hochberg 方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值進行校正，并最終采用校正后的P值，即FDR(false discovery rate)作為差異表達基因篩選的關鍵指標。在篩選過程中，將FDR 小于0.01且差異倍數FC(fold change)大于等于2 作為篩選標準。其中，FC 表示兩樣品(組)間表達量的比值。

1.3.3 DEGs 功能注釋與代謝途徑富集分析 使用BLAST 軟件將Unigene 序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG 數據庫比對，使用KOBAS 得到Unigene 在KEGG 中的KEGG Orthology結果[35]，預測完Unigene 的氨基酸序列之后使用HMMER 軟件與Pfam 數據庫比對獲得Unigene 的注釋信息[36]。此外，對差異表達基因進行GO 分類[37]。

1.3.4 JA 代謝途徑相關基因篩選與驗證 通過分析DEGs 的功能注釋，篩選百香果茉莉酸代謝途徑相關基因。參照試劑盒說明書獲得逆轉錄cDNA。根據篩選出的基因的Unigene 序列設計并合成引物進行qRTPCR。檢測引物的特異性和擴增效率后，根據qRTPCR 試劑盒說明書配置反應液，20 μL 反應體系中包含反應液10 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL、熒光染料Ⅰ(50×) 0.4 μL、cDNA 模板2.0 μL、ddH2O 6.8 μL。引物序列見表1。qRT-PCR 擴增程序:94℃預變性30 s；94℃變性10 s，退火15 s，72℃延伸10 s，循環40 次；之后溫度回升至94℃保持15 s，隨后降至60℃保持15 s，再以0.11℃·s-1的速度升溫至94℃保持15 s，繪制溶解曲線。所采集的數據采用2-ΔΔCt法[38]計算基因的相對表達量。

表1 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關基因qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

2 結果與分析

2.1 測序數據組裝與分析

由表2可知，CK 的堿基數量介于6.83 G～7.36 G之間，LT 的堿基數量介于6.59 G～7.35 G 之間。各樣品的Q20 堿基百分比均大于98%，Q30 堿基百分比均大于94%，說明所獲得的轉錄組數據質量較好。在堿基成分方面，GC 介于45%～46%之間。組裝共得到39 521條Unigene，N50 值為1 991(5.04%)，平均長度為1 145.47 bp，其中長度介于300～500 bp 的Unigene 數量為16 019，占比最大，達40.53%(表3)。由圖1所示的6 個樣品主成分分析(principal component analysis，PCA)結果可知，CK 與LT 分別聚為一類，即生物學重復樣品間重復性好。由此可見，百香果低溫脅迫轉錄組的組裝結果的完整性較高，可用于后續分析。

表2 樣品測序數據評估統計表Table 2 Data evaluation statistics of transcriptome

表3 組裝結果統計表Table 3 Statistics of transcriptome assembly results

2.2 Unigene 注釋

低溫脅迫下，百香果轉錄組測序獲得的Unigene注釋結果如圖2所示。最終獲得28 889 個有注釋信息的Unigene，占所有Unigene 的73.10%。其中長度大于等于300 bp 且小于1 000 bp 的Unigene 數量為15 756(54.54%)，大于等于1 000 bp 的數量為13 133(45.46%)。在這些數據庫中，COG 數據庫注釋Unigene 數量最少，為9 585，占比僅為33.18%；GO 數據庫注釋Unigene 數量為17 530，占比60.68%；KEGG數據庫注釋Unigene 數量為11 811，占比40.88%；KOG 數據庫注釋Unigene 數量為16 528，占比57.21%；Pfam 數據庫注釋Unigene 數量為19 865，占比68.76%；Swiss-Prot 數據庫注釋Unigene 數量為20 728，占比71.75%；eggNOG 4.5 數據庫Unigene 數量為27 410，占比94.89%；注釋NR 數據庫注釋Unigene數量最多，為28 755，占比高達99.54%。

2.3 差異表達基因鑒定

基于DEGs 分析結果，不同處理和生物重復間百香果轉錄組相關性分析結果如圖3-A 所示，CK 的3 個生物重復樣品與LT 的3 個生物重復樣品均分別聚為一類，不同處理間轉錄組的相似系數介于0.573～0.761，說明轉錄組差異基因篩選結果較為可靠。進一步篩選，低溫脅迫處理后獲得百香果5 311 個DEGs(圖3-B)，其中LT 相對于CK 上調表達基因數量為2 533(47.69%)，下調表達基因數量為2 778(52.31%)。

2.4 差異表達基因GO 分類

被GO 注釋的17 530 個Unigene 中DEGs 為2 601個(14.84%)。轉錄組差異表達基因GO 分類結果如圖4所示，被注釋的Unigene 分為細胞組件、分子功能及生物過程三大類。其中，細胞組分大類可進一步分為16 個小類；分子功能大類分為15 個小類；生物過程大類分為21 個小類。

根據GO 分類結果，DEGs 數量最多的亞類為生物過程大類的代謝過程，數量為1 414，占該類型Unigene總數15.08%，包括甾醇生物合成、類黃酮糖脂化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長鏈脂肪-酰基輔酶A 代謝等。DEGs占該類型Unigene 總數比例最大的小類為分子功能大類中的金屬伴侶蛋白活性亞類，僅包含2 個Unigene，其中一個為差異基因即細胞色素C 氧化酶基因，另一個是銅/鋅超氧化物歧化酶基因。此外，生物過程大類中信號小類注釋的差異基因數量為118，占該類型Unigene 比例為14.82%，包括3 個親離子谷氨酸受體信號通路的谷氨酸受體基因，即c50649.graph＿c0(GLR3.7)、c53352.graph＿c0(GLR3.2)和c54428.graph＿c0(GLR2.7)。

2.5 KEGG 富集分析

KEGG 富集結果中，DEGs 數量排名前十和具有顯著性差異的KEGG 代謝途徑如表4和表5所示。從所獲得的DEGs 數量上看，百香果低溫脅迫下富集的主要代謝通路包括核糖體、淀粉與蔗糖代謝、植物激素信號轉導、碳代謝、氨基酸生物合成、植物與病原體互作、內質網蛋白加工、苯丙素生物合成、嘌呤代謝和內吞作用等10 種。以P值作為參考，KEGG 富集的顯著性代謝通路有核糖體、淀粉與蔗糖代謝、氰胺酸代謝、植物與病原體互作、DNA 復制、植物信號轉導途徑、核糖體在真核生物中的生物發生、卟啉和葉綠素代謝、單萜類生物合成、牛磺酸和次?；撬岽x。其中，核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號轉導途徑及植物與病原體互作途徑中DEGs 數量較多，且差異存在顯著性，可能是參與百香果低溫脅迫響應的重要代謝途徑。植物激素信號轉導在多種植物抗寒或低溫脅迫響應過程中均發揮了重要生物學功能。為進一步研究百香果激素信號途徑響應低溫脅迫的機制，本試驗對低溫脅迫下該途徑的DEGs 進行了分析。

表4 差異基因數量前十的KEGG 代謝途徑Table 4 Top 10 KEGG pathways of DEGs number

表5 顯著性差異的KEGG 代謝途徑Table 5 Significant difference KEGG pathways

百香果低溫脅迫過程中，激素信號轉導途徑的DEGs 如表6所示，其中，上調表達基因為42 個，下調表達29 個，總體上看激素信號轉導代謝被激活了。這些差異表達基因中，生長素、JA、ABA 等激素信號轉導途徑的關鍵基因，例如MYC2、生長素相應因子基因(auxin response factor，ARF)、吲哚乙酸氨基化合成酶基因(indole-3-acetic acid-amido synthetase gene，GH3)、生長素響應蛋白基因(auxin-responsive protein gene，SAUR)、蛋白磷酸酶2C 基因(protein phosphatase 2C gene，PP2C)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2 基因(serine/threonine-protein kinase SRK2 gene，SRK2)等同時存在上調和下調表達類型，說明這些基因的不同成員可能在低溫脅迫過程中存在功能多樣性；油菜素內酯信號轉導途徑相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BSK基因(serine/threonine-protein kinase BSK gene，BSK)與植物轉錄因子基因(plant transcription factor BZR，BZR)上調表達，而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BRI1 基因(serine/threonine-protein kinase BRI1 gene，BRI1)下調表達；乙烯信號轉導途徑相關乙烯受體蛋白基因(ethylene receptor gene，ETR)、受體互作蛋白持續三重反應基因1(constitutive triple response gene1，CTR1)、乙烯不敏感基因3(ethylene insensitive gene 3，EIN3)、乙烯不敏感基因3 F-box 結合蛋白基因(EIN3-binding F-box protein gene，EBF)與乙烯受體轉錄因子1 基因(ethylene-responsive transcription factor 1，ERF1)均呈上調表達趨勢；生長素信號轉導途徑相關生長素蛋白基因(auxin protein gene，AUX)、吲哚乙酸蛋白基因(indoleacetic acids protein gene，IAA)與轉運抑制響應蛋白基因1(transport inhibitor response protein gene 1，TIR1)均下調表達；細胞分裂素信號轉導途徑中的關鍵基因細胞分裂素結合受體組氨酸激酶基因(arabidopsis histidine kinase gene 2/3/4，AHK2/3/4)與磷酸轉運蛋白基因(arabidopsis histidinephosphotransfer protein gene，AHP)均下調表達；赤霉素抑制基因DELLA下調表達；水楊酸代謝途徑關鍵基因TGA轉錄因子(transcription factor TGA)和病程相關蛋白基因1(pathogenesis-related protein gene 1，PR-1)也呈下調表達趨勢。可見，生長素、細胞分裂素、ABA、乙烯、油菜素內酯、JA、水楊酸等植物激素均參與了百香果低溫脅迫響應過程。值得注意的是，茉莉酸途徑相關的JAR1 與JAZ均上調表達而COI1 下調表達，而與ABA 途徑的連接橋梁PYL基因上調表達，而MYC2 家族不同成員同時存在上調和下調表達的現象，說明該代謝途徑在百香果低溫脅迫響應過程中存在重要的調控功能。

表6 植物激素信號轉導途徑中差異基因統計表Table 6 Statistics of DEGs in plant hormone signal transduction pathway

2.6 JA 代謝相關基因挖掘

低溫脅迫下，百香果茉莉酸信號轉導途徑及相關基因的變化如圖5，其中JAR1 和JAZ為上調表達基因，COI1 為下調表達基因，MYC2 基因同時存在上調和下調表達。此外，AOC、AOS與PYL也是植物茉莉酸代謝過程中的關鍵節點基因。這些基因在不同處理組中的FPKM(fragments per kilobase million)值的變化趨勢及qRT-PCR 驗證結果如表7所示，FPKM 值與qRTPCR 驗證結果的變化趨勢基本一致但變化的幅度略有差異。與CK 相比，LT 中c27852.graph＿c0(AOC)、c48197.graph＿c0(JAR1)、c52002.graph＿c0(JAZ)、c52048.graph＿c0(JAZ)、c49063.graph＿c0(MYC2)、c54914.graph＿c0(MYC2)與c36787.graph＿c1(PYL)均顯著上調表達，而c55075.graph＿c0(COI1)顯著下調。然而，與CK 相比，LT 中c54609.graph＿c0(AOS)、c42174.graph＿c0(JAZ)、c36235.graph＿c0(MYC2)及c54944.graph＿c0(PYL)的FPKM 值無顯著差異，但qRT-PCR 相對表達量明顯上調，分別達到CK 的3.35、2.49、1.62 及2.68 倍?？梢?，低溫處理能夠促進百香果茉莉酸生物合成相關的AOC與AOS轉錄，且受JA 直接正調控的JAR1、調控抗寒相關功能基因表達的MYC2 以及茉莉酸途徑與ABA 途徑關聯基因PYL的表達水平也顯著提高，與JA 在模式植物低溫脅迫下的響應機制基本一致。然而，低溫處理后，百香果中COI1 表達水平下降進而負調控JAZ表達水平上升，這一結果有待進一步研究。

表7 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關基因FPKM 值與qRT-PCR 相對表達Table 7 The FPKM value and relative expression by qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

3 討論

高通量轉錄組測序是植物差異表達基因挖掘、代謝調控網絡構建和生物學機理研究的重要手段。本研究中，百香果轉錄組各樣品的Q20 的堿基百分比均大于98%，且Q30 的堿基百分比均大于94%[39]，GC 含量介于45%～46%之間[5，40]，Unigene 的N50 值大于長度平均值，此外qRT-PCR 驗證的基因表達趨勢基本與轉錄組FPKM 值預測基本一致。因此，所獲得的轉錄組數據結果較好，能夠滿足后續分析要求。

由百香果低溫脅迫轉錄組GO 分類的結果可知，生物過程大類中的代謝過程是DEGs 數量最多的類型，其注釋的DEGs 涉及甾醇生物合成、類黃酮葡萄苷酸化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長鏈脂肪-酰基輔酶A 代謝等生物過程。這些代謝途徑或信號轉導過程在其他植物中的生物調控功能也已有相關報道。其中，甾醇生物合成過程與長鏈脂肪-?；o酶A 代謝過程與植物細胞的質膜穩定性有關[41-42]，類黃酮葡萄苷酸化能夠促進植物體內類黃酮葡萄苷酸化進而提高其解毒能力[43]，酪氨酸代謝與L-苯丙氨酸生物合成可能促進植物體內酚類物質的合成[44]，芥子油苷代謝能夠調控芥子油苷合成與分解且與茉莉酸途徑相關[45]，而軟木脂生物合成會促進細胞壁成分之一的軟木脂合成[46]。此外，GO 分類的信號亞類注釋的DEGs 中包括3 個谷氨酸受體基因，即GLR3.7、GLR3.2 和GLR2.7，與前人的研究報道一致[47]，而這3 個GLR基因家族成員編碼冷受體的功能上的區別與聯系還需進一步研究。

基于KEGG 富集分析結果，低溫處理后百香果通過核糖體、淀粉與糖代謝、植物激素信號轉導及植物與病原菌互作等多個途徑綜合作用提高自身對低溫的抵抗能力。其中，作為調控植物生長發育和抗逆境脅迫重要的過程，植物激素信號轉導途徑同樣在百香果低溫脅迫過程中存在顯著變化。低溫處理后，百香果中抗性相關的JA、ABA 與赤霉素等激素信號轉導途徑均被激活[9，11，48-49]，而與植物生長相關的生長素與細胞分裂素等代謝途徑總體上被抑制導致百香果體內生長素與細胞分裂素含量下降，進而影響JA 與ABA 等代謝途徑[50-51]。

低溫脅迫后，百香果茉莉酸信號轉導途徑中，AOC[21]與AOS[20，52]通過提高自身表達量從而促進茉莉酸類物質的生物合成，經過JAR1[25]等基因的信號傳遞從而提高MYC2[53]的表達，進而提高相關抗寒功能基因的表達。同時，以PYL作為橋梁，茉莉酸信號亦被傳遞到ABA 途徑，共同提高百香果的抗低溫能力[34，54]。此外，本試驗中，JAR1 對COI1 的調控可能隨著低溫處理的進程或因COI1 不同成員之間的區別而變化，同樣，JAZ不同成員對MYC2 的調控也存在類似現象，產生這種現象的原因則有待進一步驗證和研究[32-33]。

4 結論

本試驗所獲得的百香果測序結果較為可靠準確，其中核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號轉導途徑及植物與病原體互作途徑是百香果響應低溫脅迫的重要代謝途徑。此外，茉莉酸代謝途徑的關鍵基因AOC、AOS、JAR1 與PYL對低溫脅迫的響應機制與模式植物基本一致，但COI1 和MYC2 等基因的調控方式較為特殊。本研究結果為揭示百香果抗寒機制提供了科學參考。