我國花生土壤黃曲霉菌分布與產后花生黃曲霉毒素污染相關性研究

楊博磊 耿海榮 王 剛 張晨曦 李 麗 聶呈榮 邢福國 劉 陽

(1中國農業科學院農產品加工研究所/農業農村部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；2佛山科學技術學院，食品科學與工程學院，廣東 佛山 528231)

花生營養價值極高，含有人體必需的8 種氨基酸，同時具有抗衰老，保持皮膚滋潤細膩等功能，被譽為“長生果”，同時花生中脂肪含量高達47%～59%，是我國乃至世界的重要油料作物[1]。目前，全球已超過100 個國家種植花生，世界花生的種植面積約0.23 億hm2，年總產量約3 500 萬t；我國作為花生種植和生產大國，花生種植面積約0.05 億hm2，年產量約1 700 萬t[2]。然而花生在種植、收獲、儲藏和加工過程中極易受黃曲霉毒素污染，國內及國際對我國花生及其制品黃曲霉毒素超標現象時有報道。據統計，2015—2018年國家及各省(市)市場監督管理局通報我國食品真菌毒素超標事件602 起，其中花生黃曲霉毒素超標事件372 起，占62%；2015—2018年我國出口歐盟食品和飼料真菌毒素違例事件241 起，其中花生黃曲霉毒素超標事件223 起，占93%。黃曲霉毒素污染嚴重制約了我國花生產業的健康發展。

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)主要是由黃曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉菌(A.parasitica)產生的有毒次級代謝產物，具有劇毒性、致癌性和致突變性，可污染包括花生在內的幾乎所有農產品[3]。AFT 的存在形式主要有黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)，其毒性依次為AFB1＞AFG1＞AFB2＞AFG2，其中AFB1被聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)和世界衛生組織(World Health Organization，WHO)列為Ⅰ級致癌物[4-5]。基于AFT 的危害，世界各地針對花生及其制品中AFT 含量也制定了嚴格的限量標準，例如，我國對AFB1限量標準為≤20 μg·kg-1；國際食品污染物法典委員會(Codex Committee on Contaminants in Food，CCCF)對AFT 限量標準為≤15 μg·kg-1；歐盟對AFT 限量標準為≤4 μg·kg-1，AFB1為≤2 μg·kg-1；美國對AFT 限量標準為≤20 μg·kg-1，加拿大對AFT限量標準為≤15 μg·kg-1，澳大利亞/新西蘭對AFT 限量標準為≤15 μg·kg-1，日本對AFT 限量標準為≤10 μg·kg-1[6]。研究發現，土壤類型可顯著影響花生AFT污染，淋溶土壤中花生受AFT 污染的風險顯著高于變性土壤，黏土土壤中花生受AFT 污染風險顯著高于沙土土壤[7-8]。土壤中存在豐富的微生物，而花生作為一種地上開花地下結果的作物，與土壤中的微生物直接接觸，從而易受微生物侵染。國內外已經開展了花生土壤中微生物菌群分布特征研究，并根據土壤特征制定有針對性的防控措施[9-13]。戴顯紅[14]研究發現花生土壤中芽孢桿菌、乳球菌等能有效抑制黃曲霉菌生產和產毒，從而降低花生產后AFT 污染風險。朱婷婷[15]和張初署[16]研究發現，土壤中不產毒黃曲霉菌能夠抑制產毒黃曲霉菌生長和產毒，同時根據花生土壤中黃曲霉菌的分布、產毒特征等信息，評估了我國不同產區花生產后AFT 污染的風險，但并未進行實際監測。

本研究從我國4 個典型花生產區黃河流域產區(河北保定)、西北產區(新疆吐魯番)、長江流域產區(湖北黃岡、四川南充)和東南沿海產區(廣東湛江)采集花生土壤樣品124 份，進行花生土壤黃曲霉菌分布及產毒能力研究，并在所在產區收集花生樣品64 份開展產后花生AFT 污染調查，探究花生土壤中黃曲霉菌分布及產毒能力與產后花生AFT 污染的相關性，以期為我國花生AFT 污染監測預警和防控提供理論依據，這對提高我國花生質量安全和促進我國花生產業健康發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年從我國黃河流域產區(河北保定)、西北產區(新疆吐魯番)、長江流域產區(湖北黃岡、四川南充)和東南沿海產區(廣東湛江)4 個典型花生主產區采集花生樣品64 份，土壤樣品124 份，其中黃棕壤38 份(湖北黃岡和四川南充)、紅壤土32 份(廣東湛江)、沙壤土54 份(河北保定和新疆吐魯番)。

DG-18 培養基，青島海博生物技術有限公司；蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，美國Fisher 公司；黃曲霉毒素免疫親和柱，中檢環貿生物技術(北京)有限公司；AFB1標準品，青島普瑞邦生物工程有限公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Vertical 高壓蒸汽滅菌鍋，臺灣造鑫公司；HR3011 A2 型生物安全柜，青島海爾特種設備有限公司；Genius 3 渦旋混合器，德國IKA 公司；Sigma1-14小型高速離心機，美國Sigma 公司；Agilent 1260 高效液相色譜，TC-C18 色譜柱，美國Agilent 公司；HF2500光化學衍生器，北京華安麥科生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤中黃曲霉菌的篩選及分離純化 在超凈工作臺中稱取10 g 土壤樣品，倒入無菌300 mL 三角瓶中，加入90 mL 無菌蛋白胨水溶液(蛋白胨濃度為0.1%)，封口震蕩30 min，靜置10 min，取上清為原濃度菌懸液，取1 mL 原濃度菌懸液加入裝有9 mL 濃度為0.1%的蛋白胨水溶液中，渦旋混勻，制成10 倍稀釋液。所有土樣按此操作依次進行10 倍稀釋。取100 μL 原濃度菌懸液和稀釋液，分別涂布于DG-18 平板，在28℃培養箱中倒置培養5 d，之后進行菌落計數。選取長有黃綠色孢子的黃曲霉菌或寄生曲霉菌在DG-18 平板上進行2 次分離，直至得到單個菌落。

1.3.2 黃曲霉菌的鑒定 將分離純化的單個菌落送至青島派森諾基因科技有限公司進行真菌鈣調基因序列測序，測序結果在BLAST researches 上進行比對。

1.3.3 黃曲霉菌產毒能力分析 菌株在DG-18 培養基上28℃活化7 d，用0.1%吐溫80 配制菌懸液，調整孢子濃度至107cfu·mL-1，取100 μL 孢子液接種到10 mL 產毒培養基中，28℃、200 r·min-1培養7 d，取1 mL菌懸液，加入3 mL 84%乙腈，渦旋充分混勻，取2 mL提取液依據黃曲霉毒素免疫親和柱操作方法提取AFB1，加入23 mL 50 mmol·L-1PBS(pH 值7.4)上柱，流速控制在1～3 mL·min-1，待樣品完全通過凝膠后，用10 mL 10 mmol·L-1PBS/甲醇(90/10，v/v)溶液洗滌凝膠，然后用1 mL 甲醇洗脫AFB12 次，洗脫液過0.22 μm 濾器，轉移至進樣瓶，用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測。

HPLC 檢測條件:TC-C18 色譜柱(4.6 nm×250 mm，5 μm)，柱 溫30℃，流 動 相70% 甲 醇，流 速1 mL·min-1，進樣量20 μL，激發波長360 nm，發射波長440 nm，配備光化學衍生器。

黃曲霉菌產毒濃度=HPLC 檢測濃度×稀釋濃度

1.3.4 土壤中黃曲霉的檢出率 土壤樣品黃曲霉的檢出率是指每個采樣地樣品中能夠分離出黃曲霉菌的樣品占總樣品的百分數。

1.3.5 花生樣品處理及黃曲霉毒素檢測 依據GB 5009.22-2016 《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B 族和G 族的測定》[17]處理花生樣品并測定黃曲霉毒素。

1.4 數據分析

采用SPSS Inc 軟件進行統計分析。采用方差分析(ANOVA)對數據進行分析，采用Tukey 多區間檢驗確定平均值間的差異(P≤0.05)。采用Microsoft Excel 2007 制圖。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉菌的分離純化

采用稀釋法分別對河北保定、新疆吐魯番、湖北黃岡、四川南充和廣東湛江共124 份土壤樣品進行黃曲霉菌和寄生曲霉菌分離、純化，篩選獲得可產黃綠色孢子菌共計203 株。

2.2 黃曲霉分子生物學鑒定

利用真菌ITS 鑒定方法，把分離純化出的產黃綠色孢子菌株送至青島派森諾基因科技有限公司，經過菌株PCR、PCR 產物純化及測序，獲得的測序結果于NCBI 核酸數據庫中進行BLAST 數據比對分析，共篩選獲得黃曲霉菌165 株，寄生曲霉0 株。

2.3 不同地區花生種植土壤黃曲霉菌分布

由表1可知，5 個取樣點花生土壤中，湖北黃岡地區篩選獲得的黃曲霉菌最多，為66 株，菌落數范圍為0～1 700 cfu·g-1，平均值為314 cfu·g-1，檢出率為61.90%；其次為四川南充，黃曲霉菌為33 株，菌落數范圍為0～700 cfu·g-1，平均值為194 cfu·g-1，檢出率為64.71%；廣東湛江地區共篩選獲得黃曲霉菌35 株，檢出率為50.00%，菌落數范圍為0～700 cfu·g-1；最低為河北保定，黃曲霉菌為5 株，菌落數范圍為0～200 cfu·g-1，平均值為25 cfu·g-1，檢出率為15.00%。表明我國南方氣候潮濕地區，土壤中黃曲霉菌數量高于北方地區。

表1 不同地區花生種植土壤中黃曲霉菌分布Table 1 Distribution of A.flavus in peanut fields in different regions

2.4 不同地區花生土壤中黃曲霉產毒特征研究

根據產毒能力不同，黃曲霉菌被分為4 個水平，分別為高產毒菌(AFB1＞1 000 μg·kg-1)、中產毒菌(AFB1＞100～1 000 μg·kg-1)、低產毒菌(AFB1＞0～100 μg·kg-1)和不產毒菌(AFB1=0 μg·kg-1)[16]。由表2可知，在河北保定、新疆吐魯番、湖北黃岡、四川南充和廣東湛江5 個地區分離的黃曲霉菌種，不產毒菌所占比例分別為0%、15.38%、12.12%、27.27%和2.94%，四川南充不產毒菌所占比例高于其他地區；低產毒菌在5 個地區所占比例均相對較高，其中廣東湛江低產毒菌所占比例高于其他地區；中產毒菌在河北保定所占比例最高，為60.00%，其次為廣東湛江，占29.41%，四川南充所占比例最低，為21.21%；河北保定不存在高產毒菌，四川南充高產毒菌所占比例最高，為12.12%。湖北黃岡、廣東湛江、四川南充和新疆吐魯番分離的低產毒菌所占比例相對較高，而河北保定分離的中產毒菌所占比例最高。由于河北保定篩選出的黃曲霉菌數量較少，因此不能很好的體現河北保定地區土壤中黃曲霉菌的產毒特征。

表2 不同地區花生種植土壤中黃曲霉菌產AFB1 能力分布Table 2 Producing ability of AFB1 of A.flavus in peanut fields in different regions

2.5 不同地區花生受黃曲霉污染風險分析

由表3可知，5 個地區中黃曲霉平均產AFB1量以及每克土壤中產AFB1量存在較大差異。黃曲霉平均產毒量最高的地區是四川南充，為707 μg·kg-1，產毒范圍是0～12 118 μg·kg-1；其次是湖北黃岡，平均產毒量為599 μg·kg-1，產毒范圍是0～24 005 μg·kg-1；廣東湛江地區黃曲霉平均產毒量為377 μg·kg-1；河北保定地區黃曲霉平均產毒量為172 μg·kg-1；黃曲霉平均產毒量最低的是新疆吐魯番，為141 μg·kg-1。每克土壤中平均產AFB1量較高的地區是湖北黃岡和四川南充，達到了130 000 μg·kg-1·g-1以上；其次是廣東湛江和新疆吐魯番地區，分別為41 093 μg·kg-1·g-1和10 716 μg·kg-1·g-1；河北保定最低，為4 300 μg·kg-1·g-1。說明，湖北黃岡產后花生受AFB1污染風險最高，其次為四川南充、廣東湛江和新疆吐魯番，河北保定產后花生受AFB1污染風險最低。

表3 不同地區花生土壤中黃曲霉菌平均產AFB1 量Table 3 Quantities of aflatoxin B1 produced by A.flavus isolated among peanut fields in different regions

2.6 不同地區產后花生黃曲霉毒素污染情況分析

由表4可知，5 個地區花生樣品中均檢測到AFB1，檢出率分別為13%(河北保定)、14%(新疆吐魯番)、57%(湖北黃岡)、38%(四川南充)和31%(廣東湛江)。河北保定、新疆吐魯番、廣東湛江和四川南充未檢測到花生AFB1超標情況，湖北黃岡檢測到2 份花生樣品AFB1超標，超標率為10%，檢出濃度分別為97.93 μg·kg-1和31.79 μg·kg-1。由此可知，湖北黃岡產后花生受AFB1污染最嚴重，其次為四川南充、廣東湛江、新疆吐魯番，河北保定產后花生受AFB1污染較輕。花生受AFB1污染風險分析結果與實際檢測結果一致。

3 討論

花生是我國重要的油料與經濟作物，營養價值豐富，有益人體健康。我國是世界花生出口第一大國，占花生國際市場總貿易的40%以上。然而花生極易受AFT 污染，僅2018年歐盟通報我國花生AFT 超標事件就41 起，占我國出口歐盟食品和飼料違例事件的19%，AFT 已成為限制我國花生出口貿易的主要危害因子。花生中黃曲霉菌的主要來源是土壤，花生莢果黃曲霉帶菌量與土壤中黃曲霉數量呈正相關性[18-20]。研究發現，我國土壤中黃曲霉菌分布有明顯的地域性特征，長江流域土壤中黃曲霉菌量最多，其次為東南沿海地區，再次為黃河流域，東北地區黃曲霉菌量最少，由南到北土壤中黃曲霉菌數量逐漸減少[3，15-16]。本研究結果表明，湖北黃岡土壤黃曲霉菌帶菌量最高，為314 cfu·g-1，其次四川南充為194 cfu·g-1，河北保定土壤黃曲霉帶菌量最少，為25 cfu·g-1。表明我國花生土壤中黃曲霉菌落數與生態環境存在相關性，氣候潮濕、溫度較高的長江和東南沿海產區土壤中黃曲霉菌落數較多，氣候干燥、溫度較低的北方和西北產區土壤中黃曲霉菌落數較少。我國上述5 個地區花生土壤中黃曲霉菌平均菌落數范圍為25～314 cfu·g-1，與國外相比，低于美國愛荷華州玉米和谷物土壤中黃曲霉菌落數(396 cfu·g-1)和美國密西西比州小麥土壤中黃曲霉菌落數(457 cfu·g-1)[21-22]，高于日本神奈川縣花生土壤中黃曲霉菌落數(9 cfu·g-1)[23]，其中廣東湛江花生土壤中黃曲霉菌菌落數與阿根廷玉米土壤中黃曲霉菌菌落數(100 cfu·g-1)相當[24]。

表4 不同地區產后花生AFB1 污染情況Table 4 The contaminated situation of AFB1 in harvest peanut in different regions

針對全國花生土壤中黃曲霉菌產毒能力研究，張初署[16]發現我國花生土壤中產毒菌所占比例為69%，不產毒菌所占比例最高，為31%；朱婷婷[15]發現我國花生土壤中產毒菌所占比例為79%，其中低產毒菌所占比例最高，為43%；張杏[3]發現我國花生土壤中產毒黃曲霉菌比例為85%，其中高產毒菌所占比例最高，為44%。本研究發現，花生土壤中黃曲霉菌產毒菌所占比例為87%，其中低產毒菌所占比例為52%，中產毒菌所占比例為27%。綜合多次研究結果發現，我國花生土壤中產毒黃曲霉菌平均比例為70%～85%，但低、中和高產毒菌所占比例差異較大，分析可能與取樣當年季節氣候以及土壤類型等有關。針對個別花生產區花生土壤中黃曲霉菌產毒能力研究，朱婷婷等[25]發現湖北地區花生土壤黃曲霉平均菌落數為128 cfu·g-1，其中產毒黃曲霉菌占96%。張杏等[26]發現西南地區四川蓬安花生土壤黃曲霉平均菌落數為212 cfu·g-1，其中產毒黃曲霉菌占100%。本研究中，湖北黃岡地區花生土壤黃曲霉平均菌落數為314 cfu·g-1，其中產毒黃曲霉菌約占88%，土壤帶菌量高于朱婷婷等[25]的研究結果，但產毒菌比例低于其結果；四川南充地區花生土壤黃曲霉平均菌落數為194 cfu·g-1，產毒黃曲霉菌約占73%，其中土壤帶菌量與張杏等[26]的調查結果相近。

通過對不同地區花生受AFT 污染風險分析發現，湖北黃岡花生受AFT 污染風險最大，每克花生土壤中AFB1平均產量為188 086 μg·kg-1；其次為四川南充、廣東湛江和新疆吐魯番；河北保定花生受AFB1污染風險最小。這與張初署[16]研究結果一致，即通過對全國花生土壤中AFB1產量調查發現，長江流域土壤中AFB1產量最高，花生受AFT 污染風險最高。朱婷婷[15]研究發現南方產區花生受AFT 污染風險最高，其次為長江流域產區，東北產區花生受AFT 污染風險最低。河北和新疆氣候環境相似，取樣當年新疆未存在極端天氣，氣候與常年類似，然而本研究發現新疆土壤中黃曲霉菌數量是河北地區的3.04 倍，且每克土壤產AFB1量是河北的2.49 倍，同時土壤中還存在高產毒黃曲霉菌。因此新疆吐魯番地區花生AFT 污染風險遠高于河北保定地區。新疆地廣人稀，花生產業潛力巨大，需更加重視花生AFT 的防控工作。

產后花生AFT 污染調查發現，長江流域的湖北黃岡和四川南充AFB1檢出率較高，同時在湖北黃岡地區檢測到2 份樣品AFB1超標；其次為東南沿海的廣東湛江，檢出率為31%；河北保定和新疆吐魯番檢出率分別為13%和14%。AFB1檢出率高低順序為湖北黃岡＞四川南充＞廣東湛江＞新疆吐魯番＞河北保定。國內研究人員也開展了全國不同地區花生AFT 污染調查。李娟[27]開展中國十二省花生AFT 污染調查，南方產區花生AFT 陽性率高于長江流域產區、北方產區和東北產區，陽性率為83.15%。丁小霞[28]完成了13 個花生主產省花生AFT 污染調查，發現長江流域產區AFT 污染最為嚴重，東北產區最輕，AFT 污染地域特征明顯。程果等[29]開展2017年花生主產區花生AFT 污染調查，發現北方產區AFT 污染風險較高，而東北產區及內蒙古未檢測到花生AFT 污染。高秀芬等[30]對吉林省、河南省、湖北省、四川省、廣東省和廣西自治區花生樣品進行AFT 污染調查，發現吉林省花生檢出率最高，為67%，河南省檢出率最低，為43%。本研究結果與丁小霞[22]的調查結果一致，長江流域產區及東南沿海產區由于氣候等因素AFT 污染較為嚴重。花生AFT 檢測結果與風險評估結果一致，花生土壤中黃曲霉菌帶菌量越多，產毒菌比例越高，產毒能力越強，產后花生受AFT 污染越嚴重。

4 結論

本研究發現我國花生種植土壤中黃曲霉菌分布呈明顯的地域性特征，湖北黃岡土壤黃曲霉帶菌量最多，檢出率最高；河北保定花生土壤帶菌量最少，檢出率最低。花生土壤中黃曲霉菌以中低產毒菌所占比例最高。通過對不同地區花生土壤AFT 污染風險評估發現，湖北黃岡地區花生受AFB1污染風險最高，其次為四川南充、廣東湛江和新疆吐魯番，河北保定風險最低。對不同產區產后花生AFB1檢測發現，湖北黃岡產后花生AFB1檢出率最高，河北保定AFB1檢出率最低，花生AFB1污染檢測結果與風險評估結果一致。說明產后花生受AFB1污染情況與花生土壤中黃曲霉菌的數量、產毒菌比例及產毒能力呈極強正相關性。本研究結果表明，通過對花生土壤黃曲霉菌的風險評估可預知產后花生的AFB1污染情況，以便做好防控工作，這對提高我國花生質量水平，保障我國花生消費安全具有重要意義。