miR-499 rs3746444 位點多態性與肝細胞癌發病風險的關系

韋琴，黃冰，余紅平，秦林原，于祥遠

1 桂林醫學院公共衛生學院，廣西桂林541100；2 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院

2018 年全球腫瘤流行病統計數據顯示，全球肝癌新發病例約84.1 萬例、死亡約78.1 萬例，其中約50%的新發病例和死亡病例發生在中國［1］。肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌中最常見的類型。HCC 的病因復雜，除了與病毒性肝炎、肝硬化、酗酒、黃曲霉毒素等因素有關外，還與個體的遺傳背景有關。微小RNA（miRNA）是一類無編碼蛋白功能的內源性單鏈小分子RNA，長度18～23 nt，能夠通過與靶mRNA 的3′端非翻譯區特異性結合，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，從而參與惡性腫瘤的發生、發展［2］。miR-499 為miRNA 家族成員之一，可通過負調控功能性靶基因表達而參與HCC 細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為。單核苷酸多態性是人類基因組中最常見的遺傳變異，可決定個體罹患腫瘤的風險。目前，miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 遺傳易感性的關系尚不明確。為此，本研究系統評價了miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 遺傳易感性的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 檢索策略 計算機檢索Web of Science、PubMed、中國知網、萬方數據庫，檢索時限為建庫至2020 年6 月。中文檢索詞：microRNA-499、miR-499或miRNA-499，單核苷酸多態性，肝細胞癌或肝癌，發病風險或遺傳易感性；英文檢索詞：microRNA-499 or miR-499 or miRNA-499，rs3746444，Hepatocel?lular carcinoma or HCC or liver cancer，polymorphism，genetic variation。根據數據庫特點，采取主題詞或自由詞的方式檢索。為提高查全率和查準率，追溯納入文獻的參考文獻。

1.2 納入標準與排除標準 納入標準：①研究類型：關于miR-499 rs3746444位點多態性與HCC發病關系的病例對照研究，語種僅限中文和英文；②研究對象：病例組為經組織病理學檢查確診的HCC 患者，對照組為健康志愿者；③干預措施：病例組與對照組均行基因分型；④結局指標：miR-499 rs3746444位點基因型。排除標準：①未公開發表的文獻；②綜述、文摘、會議報告等非病例對照研究；③重復發表的文獻；④病例組或對照組有不確定基因型或等位基因的文獻。

1.3 文獻篩選與資料提取 由兩名專業研究人員分別閱讀全文，嚴格按照文獻納入標準和排除標準篩選文獻，并對納入文獻進行交叉核對。若出現分歧，討論決定或由第三人裁定。

采用統一表格提取納入文獻的相關資料，包括第一作者、發表時間、第一作者國家、研究人群、基因分型方法、對照來源、樣本量、哈迪—溫伯格平衡（HWE）等。

1.4 文獻質量評價 采用NOS 量表從3 個方面評價納入文獻質量，即病例組與對照組的選擇方法、病例組與對照組的可比性、接觸暴露［3］。病例組與對照組的選擇方法包括4 個評價條目，即病例的定義和診斷是否恰當、病例的代表性、對照的選擇、對照的定義，每個評價條目1 分，共4 分。病例組與對照組的可比性僅有1 個評價條目，共2分。接觸暴露包括3 個評價條目，即暴露的調查和評估方法（2 分）、病例和對照的調查方法是否相同（1 分）、無應答率（1 分），共4 分。NOS 評分≥7 分為高質量文獻，4～6 分為中等質量文獻，＜4分為低質量文獻。

1.5 分析方法 采用Stata12.0 統計軟件進行Meta分析。采用合并的優勢比（OR）及其95%CI評估miR-499 rs3746444 位點不同遺傳模型（等位基因模型、顯性遺傳模型和雜合子模型）與HCC遺傳易感性的關系。采用Cochran′sQ檢驗進行異質性分析，當P＜0.1且I2＞50%認為各研究間存在異質性，采用隨機效應模型進行分析；當P≥0.1 且I2≤50%認為各研究間不存在異質性，采用固定效應模型進行分析。采用Begg′s檢驗和Egger′s檢驗評估發表偏倚，并采用敏感性分析評價結果的穩健性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入文獻基本情況 根據檢索策略共獲取相關文獻175 篇，經閱讀文獻題目、摘要和全文，嚴格按照納入標準和排除標準篩選、剔除，最終納入文獻18 篇［4-21］，見表1。經NOS 量表評估納入文獻質量，其中高質量文獻11篇、中等質量文獻7篇。

2.2 Meta分析結果

2.2.1 整組分析 Meta 分析結果顯示，miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 遺傳易感性無明顯相關性（P均＞0.05），其中等位基因模型、顯性遺傳模型、雜合子模型合并的OR分別為1.14（95%CI：0.97～1.33）、1.16（95%CI：0.99～1.38）、0.87（95%CI：0.74～1.02）。

2.2.2 亞組分析 本研究按基因分型方法（PCRRFLP［4-8，10-11，13-21］、其他［9，12］）、病例組樣本量（n＞200［4，8-9，12-14，17，19］、n≤200［5-7，10-11，15-16，18，20-21］）以及是否符合HWE（符合［5，9-10，13-16，20］、不符合［4，6-8，11-12，17-19，21］）進 行 亞組分析，結果發現miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 遺傳易感性顯著相關（P均＜0.05）。在等位基因模型下，與A 等位基因比較，G 等位基因可顯著增加病例組n＞200、其他基因分型方法以及符合HWE亞組個體罹患HCC的風險（P均＜0.05）；在顯性遺傳模型下，與AA基因型比較，GG+AG基因型可顯著增加病例組n＞200、其他基因分型方法亞組個體罹患HCC的風險（P均＜0.05）；在雜合子模型下，與AA基因型比較，AG 基因型可顯著增加病例組n＞200、其他基因分型方法亞組個體罹患HCC的風險（P均＜0.05）。具體結果見表2。

2.3 發表偏倚分析 Begg′s檢驗顯示，在等位基因模型、顯性遺傳模型、雜合子模型下納入文獻的漏斗圖基本呈對稱分布（Z分別為1.06、0.83、0.83，P均＞0.05）。Egger′s檢驗顯示，在等位基因模型、顯性遺傳模型、雜合子模型下未發現存在發表偏倚（t分別為-0.51、-0.60、1.03，P均＞0.05）。

2.4 敏感性分析 采用逐一剔除文獻法，將納入文獻逐一剔除，以評估OR的穩定性，結果未發現總體效應的OR及其95%CI因單篇文獻剔除而出現明顯波動，研究結果的穩健性較好。

表2 miR-499 rs374644位點不同遺傳模型與HCC遺傳易感性的關系

3 討論

HCC 是消化系統常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、病情進展快、早期診斷困難、患者預后差等特點。目前已經明確病毒性肝炎、黃曲霉毒素、酗酒等是引起HCC 的重要危險因素。除上述危險因素外，遺傳背景差異與HCC 的遺傳易感性亦存在一定關系。因此，深入研究與HCC 遺傳易感性有關的功能性遺傳變異，將為HCC 診斷和個體化治療提供新的策略。

miRNA 是一類無編碼蛋白功能的內源性單鏈小分子RNA，能夠通過與靶mRNA 的3′端非翻譯區特異性序列完全或部分互補結合，在轉錄后水平負調控靶基因表達，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程。近年研究發現，多種實體瘤中存在miRNA 異常表達現象，這些差異表達的miRNA 能夠在轉錄或翻譯后水平調控靶基因表達，從而參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和遷移等生物學過程。因此，miRNA重要功能區域的多態性可能會影響miRNA生成及其成熟，進而改變個體對特定腫瘤的易感性。前期本課題組研究發現，miR-122 rs1135519 位點多態性與HCC 的遺傳易感性顯著相關［22］；miR-199a rs74723057 位點多態性與其靶基因間質表皮轉化因子3′端非翻譯區rs1621 位點存在交互作用，從而影響個體對HCC 的遺傳易感性［23］。miR-499為miRNA 家族成員之一，能夠通過負調控靶基因的表達而參與HCC 細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為。如miR-499 能夠通過負調控功能性靶基因星形膠質細胞上調基因1 表達，抑制HCC 細胞增殖。有研究報道，miR-499 rs3746444 位點A＞G 多態性與HCC 的遺傳易感性顯著相關［9，15，21］，但也有研究認為該位點多態性與HCC 的發病無關［16-19］。為進一步明確miR-499 rs3746444 位點A＞G 多態性與HCC 遺傳易感性的關系，本研究采用Meta 分析方法系統評價了miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 遺傳易感性的關系。

本研究Meta 整組分析顯示，miR-499 rs3746444位點多態性與HCC 遺傳易感性無明顯相關性。本研究按基因分型方法、病例組樣本量以及是否符合HWE 進行亞組分析，結果發現miR-499 rs3746444位點多態性與HCC 遺傳易感性顯著相關。其中，病例組大樣本量亞組miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 的發病顯著相關，而在小樣本量亞組中無明顯相關性，這可能是由于研究設計和研究樣本量導致的統計檢驗效能差異所致。基因分型方法PCRRFLP 亞組miR-499 rs3746444位點多態性與HCC 的發病無關，可能是因為該基因分型方法會受限制性內切酶特異性、凝膠酶成像清晰度等因素影響，從而導致基因分型結果讀取偏差。在不符合HWE 亞組中未發現miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 的發病有關，推測可能與納入研究對象的人群代表性有關。本研究納入文獻的漏斗圖基本呈對稱分布，未發現存在發表偏倚，表明納入文獻的整體代表性較好。本研究采用逐一剔除文獻法，將納入的文獻逐一剔除進行各遺傳模型下的敏感性分析，結果均未發現總體結果因單篇文獻的剔除而出現明顯波動，表明研究結果的穩健性較好。但本研究亦存在一定局限性，如納入的文獻僅為公開發表的中英文文獻，未能對納入患者的性別、年齡、吸煙、飲酒等信息進行校正，可能會影響miR-499 rs3746444 位點多態性對HCC遺傳易感性客觀效應的評估。

綜上所述，miR-499 rs3746444 位點多態性與HCC 發病風險顯著相關，此關聯僅存在于病例組較大樣本量、其他基因分型方法和符合HWE 亞組中。但本研究結論仍需進一步驗證。