血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對胰腺癌的診斷價值

呂夢，王健

鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450003

胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。近年來，隨著我國居民生活方式轉變和生活質量提高，胰腺癌的發病率明顯上升。胰腺癌起病隱匿，早期診斷困難，能夠早期診斷并接受根治性手術者僅占5%～15%，多數患者確診時已屬中晚期，治療效果不理想，預后極差［1］。因此，早期篩查、診斷進而早期治療對延長胰腺癌患者生存時間具有重要意義。有研究表明，糖類抗原（CA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）在胰腺癌的發生、發展過程中具有重要作用［2］。CA19-9是一種存在于血液循環的胃腸道腫瘤相關抗原，并且不受妊娠、吸煙、年齡等因素影響，是迄今發現的對胰腺癌敏感度最高的腫瘤標志物［3］。但鑒于腫瘤標志物單項檢測具有一定局限性，在臨床上往往聯合檢測多種腫瘤標志物，以提高診斷準確率。HOXA 末端轉錄本反義RNA（HOTTIP）屬于lncRNA家族成員之一，其作為分子向導可特異性連接并募集混合系白血病復合體/WD 重復蛋白5，激活并轉錄HOXA 基因，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學過程。有研究報道，lncRNA HOTTIP 與多種消化系統惡性腫瘤的發生、發展密切相關［4］。但目前鮮有血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯合診斷胰腺癌的報道。為此，本研究探討了血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對胰腺癌的診斷價值?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年1 月—2020 年1 月鄭州大學第二附屬醫院收治的胰腺癌患者79 例（胰腺癌組）。所有患者符合《胰腺癌綜合診治中國專家共識（2014 年版）》［5］中的診斷標準，并經術后組織病理學檢查證實。納入標準：①符合胰腺癌診斷標準；②TNM 分期［6］Ⅰ～Ⅲ期；③年齡≥18 歲；④臨床資料完整。排除標準：①合并其他良惡性腫瘤者；②合并自身免疫性疾病者；③合并心血管疾病者；④合并急慢性感染者；⑤合并血液系統疾病者。其中，男54例、女25例，年齡46～82（61.58±4.65）歲，BMI 19～29（25.32 ± 2.15）kg/m2，有吸煙史30 例，有飲酒史15 例。同期選擇鄭州大學第二附屬醫院收治的胰腺炎患者63 例（胰腺炎組），男43 例、女20例，年 齡43～85（61.28 ± 3.74）歲，BMI 18～28（24.97 ± 2.23）kg/m2，有吸煙史6 例，有飲酒史17例。同期另選在鄭州大學第二附屬醫院體檢健康的志愿者50例（對照組），男34例、女16例，年齡40～80（60.27±4.36）歲，BMI 18～28（24.87±2.18）kg/m2，有吸煙史3 例，有飲酒史9 例。三組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等臨床資料具有可比性。本研究經鄭州大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準（審批文號：2018-10-08F），所有研究對象知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 血漿CA19-9 檢測 所有研究對象入組后，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 法檢測血漿CA19-9。所有操作嚴格按ELISA試劑盒說明進行。

1.3 血漿lncRNA HOTTIP 檢測 所有研究對象入組后，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存。待標本成批后，按總RNA 提取試劑盒說明提取總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格，可用于后續實驗。按去除基因組DNA 試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，按實時熒光定量PCR 試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：lncRNA HOTTIP 上游引物5"-AGTGTGTCATAGAGCTTCCT?GTTTCATCTCCCAGT-3"，下游引物5"-TGGAAC?CAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3"；GAP?DH 上游引物5"-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3"，下游引物5"-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3"。按實時熒光定量PCR 試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃5 min，95 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s共45個循環。由ABI 7500 系統軟件SDS 自動獲取閾值循環數（CT）。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCT法計算lncRNA HOTTIP相對表達量。

1.4 資料收集與分析 收集胰腺癌患者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM 分期等臨床資料，分析血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平與患者臨床病理特征的關系。1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。采用受試者工作特征（ROC）曲線評估血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對胰腺癌的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平比較見表1。

表1 三組血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平比較（ ±s）

表1 三組血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平比較（ ±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與胰腺炎組比較，#P＜0.05。

組別n對照組胰腺炎組胰腺癌組lncRNA HOTTIP相對表達量0.54±0.05 0.57±0.17 1.31±0.29*#50 63 79 CA19-9（U/mL）23.36± 7.83 26.78± 8.47 490.26±147.78*#

2.2 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系 見表2。

表2 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關系

2.3 胰腺癌患者血漿CA19-9 水平與血漿lncRNA HOTTIP 水平的關系 Pearson 相關分析顯示，胰腺癌患者血漿CA19-9 水平與血漿lncRNA HOTTIP 水平呈正相關關系（r=0.570，P＜0.05）。

2.4 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平診斷胰腺癌的效能分析 繪制血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平單獨或聯合診斷胰腺癌的ROC 曲線，結果發現，血漿CA19-9 水平診斷胰腺癌的曲線下面積（AUC）為0.799（95%CI：0.707～0.872），其最佳截斷值為112.59 U/mL，此時其診斷胰腺癌的敏感度為77.28%、特異度為64.67%；血漿lncRNA HOTTIP水平診斷胰腺癌的AUC為0.859（95%CI：0.775～0.920），其最佳截斷值為0.75，此時其診斷胰腺癌的敏感度為68.08%、特異度為82.15%；血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯合診斷胰腺癌的AUC為0.920（95%CI：0.848～0.965），其診斷胰腺癌的敏感度為88.54%、特異度為91.06%。血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯合時診斷胰腺癌的AUC高于血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平單獨時（Z分別為3.010、2.174，P均＜0.05）。見圖1。

圖1 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平診斷胰腺癌的ROC曲線

3 討論

據全球疾病負擔研究報道，2017 年我國胰腺癌的發病率和病死率分別為5.92/10 萬、6.02/10 萬，較1990 年分別增長了180.45%、184.80%［7］，已成為威脅我國居民健康的一大殺手。有研究認為，早期診斷和根治性手術治療是影響胰腺癌患者預后的重要因素［8］。組織病理學檢查是目前診斷胰腺癌的金標準。但胰腺位于腹膜后，位置較深并且毗鄰血管，周圍結構復雜，難以獲取病變組織。超聲、MRI、CT等影像學檢查是診斷胰腺癌的常用方法，但由于胰腺位置和周圍結構的原因，缺乏足夠的敏感度和特異度，特別是直徑＜2 cm 的病變組織，診斷準確率較低。腫瘤標志物是腫瘤細胞產生并釋放入血液的多肽、激素、蛋白抗原等物質，正常人體內含量極低。近年來，隨著生物醫學技術的發展，許多腫瘤標志物研究取得了較大進展，有效地彌補了影像學診斷滯后的缺點。

CA19-9 是一種存在于血液循環的胃腸道腫瘤相關抗原，與Lewis 血型成分有關，非腫瘤細胞特有，也存在于結腸、胃、胰腺等正常組織細胞中。生理狀態下，人體內CA19-9 含量極低，僅在某些惡性腫瘤發生時明顯升高，是迄今發現的對胰腺癌診斷敏感度最高的腫瘤標志物［9］。本研究結果發現，胰腺癌組血漿CA19-9 水平明顯高于胰腺炎組和對照組，而胰腺炎組與對照組比較差異無統計學意義，提示胰腺癌患者血漿CA19-9水平明顯升高，并且不受急慢性胰腺炎癥的影響。本研究結果顯示，血漿CA19-9 水平與胰腺癌腫瘤直徑、TNM 分期有關，隨著胰腺癌腫瘤體積增大和TNM 分期升高，血漿CA19-9 水平逐漸升高，提示血漿CA19-9 水平能夠反映胰腺癌病情程度。隨著胰腺癌病情加重，細胞變性壞死增多，組織破壞嚴重，導致大量的CA19-9釋放進入血液循環。同時，胰腺癌細胞破壞可引起胰管梗阻，導致胰島纖維化，降低或延遲胰島素分泌進而引起糖代謝紊亂，在高糖狀態下，葡萄糖與Lewis血型物質寡糖基序發生非酶促反應，連接Lewis血型物質還原端和非還原端，從而引起血液CA19-9水平升高［10］。DOLSCHEID-POMMERICH 等［11］研究報道，在健康志愿者、非腫瘤性疾病及惡性腫瘤患者血清中均檢測到CA19-9，但相比惡性腫瘤患者，健康志愿者和非腫瘤性疾病患者血清CA19-9 水平處于低水平或一過性升高，提示血清CA19-9水平升高與惡性腫瘤的發生有關。但也有研究報道，胰腺癌患者腫瘤直徑和TNM 分期與血清CA19-9 水平無關［12］，可能與入選病例的Lewis 血型抗原為陰性有關。這從側面反映不能單純以血漿CA19-9 水平來判斷腫瘤大小和臨床分期。因此，在臨床上需要聯合其他腫瘤標志物以提高診斷效能，彌補單項檢測的不足。

lncRNA 為一類轉錄本長度超過200 nt 的非編碼RNA 分子。隨著基因測序、基因芯片等技術的不斷發展，目前已發現約3 萬種lncRNA。研究表明，lncRNA 能夠在轉錄及轉錄后水平調節蛋白編碼基因的表達，可作為癌基因或抑癌基因的調控因子，參與調節腫瘤的生物學行為［13］。lncRNA HOTTIP是一種定位于HOXA 基因5′末端的lncRNA。有研究認為，lncRNA HOTTIP具備原癌基因特征，可促進多種腫瘤細胞的增殖［14］。LI 等［15］研究發現，胰腺癌細胞lncRNA HOTTIP 高表達，其高表達能夠促進胰腺癌的發生、發展；通過siRNA干擾下調胰腺導管癌細胞lncRNA HOTTIP表達后，胰腺導管癌細胞的增殖、侵襲等能力明顯降低，對化療藥物的敏感度明顯升高。本研究結果發現，胰腺癌組血漿lncRNA HOT?TIP 水平明顯高于胰腺炎組和對照組，而胰腺炎組與對照組比較差異無統計學意義，提示胰腺癌患者血漿lncRNA HOTTIP 水平明顯升高，并且不受急慢性胰腺炎癥的影響。lncRNA HOTTIP可競爭性結合miR-137，從而抑制miR-137 的抑癌作用，激活磷脂酰肌醇3-激酶信號通路，磷脂酰肌醇3-激酶信號通路被激活則會磷酸化信號通路中的雷帕霉素靶蛋白和蛋白激酶B，促進腫瘤細胞增殖，并誘導正常細胞惡性轉化和凋亡抵抗，導致惡性腫瘤的發生、發展［16］。本研究結果發現，血漿lncRNA HOTTIP 水平與胰腺癌腫瘤直徑和TNM 分期有關，這可能與lncRNA HOTTIP 的凋亡抑制作用有關。有研究發現，lncRNA HOTTIP 能夠通過抑制促凋亡基因Bcl-2相關X 蛋白表達，進而激活β 連環蛋白細胞信號通路，抑制腫瘤細胞程序性死亡過程，引起腫瘤細胞過度增殖和凋亡抑制，最終導致腫瘤惡性進展［17］。

本研究結果還發現，胰腺癌患者血漿CA19-9水平與血漿lncRNA HOTTIP 水平呈正相關關系，這可能與lncRNA HOTTIP 能夠調控CA19-9 水平有關。研究表明，lncRNA HOTTIP能夠通過負性調控miRNA表達，導致CA19-9 水平升高［18］。本研究ROC 曲線分析顯示，血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平單獨檢測時對胰腺癌的診斷均具有一定價值，但二者聯合時診斷胰腺癌的AUC 明顯高于二者單獨時，提示血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯合檢測能夠提高胰腺癌的診斷效能。

綜上所述，胰腺癌患者血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平升高，二者水平升高與胰腺癌病情進展密切相關；血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對胰腺癌的診斷均具有一定價值，二者聯合時診斷價值更高。但由于本研究樣本量有限且存在選擇偏倚，其結論還需多中心、大樣本量研究進一步證實。