血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平對結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的預測價值

張劉平，許政文，張興，何躍

遂寧市中心醫院，四川遂寧629000

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內其發病率和病死率均居惡性腫瘤前列。近年隨著社會經濟飛速發展，人民生活方式轉變，結腸癌的發病率不斷上升［1］。外科手術仍然是當前結腸癌最重要的治療手段，但術后面臨較高的復發轉移風險［2］。目前，臨床對結腸癌術后復發轉移評估主要依據臨床隨訪或影像學證據，缺少評估術后復發轉移的生物標志物。微小RNA（miRNA）是一類擁有基因調控功能的RNA，是轉錄后調控網絡的核心調控因子，能夠調控細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程［3］。miR-335-5p是miRNA家族成員之一。有研究報道，miR-335-5p在胰腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤細胞中表達下調，其表達下調能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移［4-5］。癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）是臨床常用的腫瘤診斷生物標志物，在多種惡性腫瘤中表達上調，但對診斷結腸癌的特異性不強［6-8］。本研究觀察了結腸癌患者血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平變化，并探討三者對結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的預測價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年5 月—2019 年5 月遂寧市中心醫院收治的結腸癌患者89 例（觀察組）。所有患者經術后組織病理學檢查明確診斷。納入標準：①符合結腸癌診斷標準；②首次診斷；③接受腹腔鏡手術，術前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者；③發生遠處轉移者；④預計生存期不足3 個月者。其中，男48 例、女41 例，年齡53～69（62.03 ±4.82）歲；腫瘤直徑：≥3 cm 46 例，＜3 cm 43 例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38 例，Ⅲ、Ⅳ期51 例；浸潤深度：未侵及漿膜層43例，侵及漿膜層46例；組織分化程度：低中分化53例，高分化36例。同期選擇遂寧市中心醫院收治的結腸良性病變患者61例（對照組），均接受腹腔鏡手術切除病變組織，并經術后組織病理學檢查排除惡性腫瘤。同時，排除合并其他部位惡性腫瘤者，合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者，合并急慢性感染、免疫性疾病、精神障礙性疾病者。其中，男39 例、女22 例，年齡51～70（62.09 ± 4.17）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經遂寧市中心醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血清miR-335-5p 檢測 采集所有研究對象術前外周靜脈血3 mL，注入干燥的試管內，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清中的總RNA，經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按照M-MLV逆轉錄酶試劑盒說明，將總RNA 逆轉錄為cDNA，然后按PCR 擴增試劑盒說明進行擴增。所有引物序列由上海基康生物技術有限公司設計合成。miR-335-5p 上游引物5"-ACGCT?CAGTTTAATGCTAATCGTGA-3"，下游引物5"-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTGTG-3"；U6 上游引物5"-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3"，下游引物5"-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3"。PCR反應體系：2×SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ12.5 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，上下游引物各1 μL，DEPC 水補足至25 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s 共40 個循環。所有操作在CFX96 實時熒光定量PCR 儀上完成。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算miR-335-5p 相對表達量。

1.3 血清CEA、CA19-9 檢測 采集所有研究對象術前外周靜脈血3 mL，注入干燥的試管內，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用COBAS 6000電化學發光全自動免疫分析儀檢測血清CEA、CA19-9，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.4 隨訪 結腸癌患者腹腔鏡術后定期行腸鏡、腹部CT 或B 超、胸部X 線等檢查，每6 個月一次，評估結腸癌復發轉移情況。結腸癌復發轉移標準：結腸癌術后出現新的結腸癌病灶或出現盆腔轉移灶，伴或不伴遠處轉移病灶。隨訪截至2020 年5 月，以出現結腸癌復發轉移為終點事件。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 法。危險因素分析采用Cox 回歸模型。采用受試者工作特征（ROC）曲線評估血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平對結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平比較 見表1。

表1 兩組血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平比較（±s）

表1 兩組血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組對照組CA19-9（kU/L）38.49±6.59*26.16±5.13 n 89 61 miR-335-5p 0.91±0.33*2.25±0.69 CEA（ng/mL）6.53±2.06*2.95±0.71

2.2 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平與結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的關系 結腸癌患者腹腔鏡術后隨訪12～36 個月、中位隨訪時間19 個月，無失訪病例。截至末次隨訪，89 例結腸癌患者腹腔鏡術后復發轉移40 例。分別以血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平的均數為臨界值，將患者分為miR-335-5p低水平者46 例與miR-335-5p 高水平者43 例、CEA低水平者40 例與CEA 高水平者49 例、CA19-9 低水平者42 例與CA19-9 高水平者47 例。miR-335-5p、CEA、CA19-9 低水平者腹腔鏡術后復發轉移率分別為58.70%（27/46）、30.00%（12/40）、30.95%（13/42），miR-335-5p、CEA、CA19-9 高水平者分別為30.23%（13/43）、57.14%（28/49）、57.45%（27/47）。miR-335-5p 低水平者腹腔鏡術后復發轉移率高于miR-335-5p 高水平者，而CEA、CA19-9 低水平者腹腔鏡術后復發轉移率低于CEA、CA19-9 高水平者（χ2分別為8.618、6.521、6.100，P均＜0.05）。

2.3 影響結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的危險因素分析 影響結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的單因素分析結果見表2。以結腸癌腹腔鏡術后復發轉移（0=否，1=是）為因變量，以TNM分期（0=Ⅰ、Ⅱ期，1=Ⅲ、Ⅳ期）、浸潤深度（0=未侵及漿膜層，1=侵及漿膜層）、組織分化程度（0=高分化，1=低中分化）、miR-335-5p（連續變量）、CEA（連續變量）、CA19-9（連續變量）為自變量，納入Cox 回歸模型，結果顯示，TNM分期、miR-335-5p、CEA、CA19-9 是影響結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表2 影響結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的單因素分析結果

2.4 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平對結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的預測價值 繪制血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平單獨和聯合預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的ROC 曲線，結果發現，血清miR-335-5p水平預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的曲線下面積（AUC）為0.876（95%CI：0.799～0.953），其cut off 值為1.03，此時其預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的靈敏度為82.50%、特異度為79.59%；血清CEA 水平預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC為0.797（95%CI：0.706～0.898），其cut off 值為5.32 ng/mL，此時其預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的靈敏度為77.50%、特異度為71.43%；血清CA19-9 水平預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC為0.722（95%CI：0.614～0.831），其cut off 值為30.18 kU/L，此時其預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的靈敏度為67.50%、特異度為63.27%；血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平聯合預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC為0.959（95%CI：0.915～1.000），其預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的靈敏度為95.00%、特異度為97.96%。血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平聯合預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC明顯高于血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水 平 單 獨（Z分 別 為2.014、2.435、2.768，P均＜0.05）。見圖1。

表3 影響結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的Cox回歸分析結果

圖1 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的ROC曲線

3 討論

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，具有高度侵襲性和轉移性，是全世界惡性腫瘤死亡的主要原因。結腸癌早期無典型癥狀，大多數患者確診時已處于中晚期，錯過了根治性手術的最佳時機［9］。外科手術是結腸癌最主要的治療手段，但術后面臨較高的復發轉移風險［2］。目前，臨床對結腸癌術后復發轉移評估主要依據臨床隨訪或影像學證據，缺少評估術后復發轉移的生物標志物。因此，探索結腸癌術后復發轉移相關的生物標志物對準確判斷患者預后具有重要意義。

CEA 是首先從結腸癌和胚胎組織中提取的一種具有人類胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于內胚層細胞分化而來的癌細胞表面。結直腸癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者血清CEA 水平明顯升高，可作為一種廣譜腫瘤標志物，用于惡性腫瘤的診斷、鑒別診斷、病情監測或療效評估等。CA19-9 是一種低聚糖類腫瘤相關的糖類抗原，由胰腺、膽管、胃、結腸、子宮內膜等組織合成，正常情況下血清中的含量很少，但在良惡性腫瘤患者血清中的含量明顯升高，可作為腫瘤診斷和鑒別診斷的生物標志物。雖然CEA、CA19-9被推薦為結直腸癌預后評估的生物標志物，但二者的特異度不強［7-8］。miR-335-5p 是miRNA家族成員之一，其表達失調與多種惡性腫瘤的發生、發展有關。AN等［10］研究認為，miR-335-5p可通過抑制下游癌基因十字形結構域蛋白2C表達，從而抑制胰腺癌進展。LIU 等［11］研究發現，上調miR-335-5p表達可抑制重組人BCL2樣2蛋白表達，增強卵巢癌細胞對順鉑的化療敏感性。DU等［12］研究報道，miR-335-5p 可與Rho 相關的卷曲蛋白激酶1（ROCK1）3′端非編碼區直接結合，進而抑制ROCK1 表達，阻止轉化生長因子β1介導的肺癌細胞侵襲和遷移。此外，miR-335-5p 還可靶向B7 同源體3（B7-H3）抑制腫瘤細胞侵襲和遷移［13］，而miR-335-5p 表達缺失可上調B7-H3表達，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，從而引起腫瘤術后復發和轉移［14］。miR-335-5p表達受競爭性內源性分化拮抗非蛋白編碼RNA（DAN?CR）調控，DANCR 能夠通過競爭性結合miR-335-5p而調控ROCK1表達，從而促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化等［15-17］。

本研究結果發現，觀察組血清miR-335-5p 水平低于對照組，而血清CEA、CA19-9 水平高于對照組；以血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平的均數為臨界值，將患者分為miR-335-5p、CEA、CA19-9 低水平者與高水平者，結果發現miR-335-5p 低水平者腹腔鏡術后復發轉移率高于miR-335-5p 高水平者，而CEA、CA19-9 低水平者腹腔鏡術后復發轉移率低于CEA、CA19-9 高水平者。提示血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平可能與結腸癌腹腔鏡術后復發轉移有關。本研究單因素分析發現，結腸癌腹腔鏡術后復發轉移可能還與TNM 分期、浸潤深度和組織分化程度有關；Cox 回歸分析發現，TNM 分期、miR-335-5p、CEA、CA19-9是影響結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的危險因素。進一步表明血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平均與結腸癌腹腔鏡術后復發轉移有關。本研究ROC曲線分析顯示，血清CEA、CA19-9水平預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC 分別為0.797、0.722，其預測靈敏度分別為77.50%、67.50%，特異度分別為71.43%、63.27%，證實血清CEA、CA19-9 水平對結腸癌腹腔鏡術后復發轉移均具有一定預測價值，但二者的靈敏度和特異度不理想；miR-335-5p 預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC 為0.876，其預測靈敏度為82.50%、特異度為79.59%，說明miR-335-5p可作為預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的生物標志物；血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平聯合預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的AUC 為0.959，其預測靈敏度為95.00%、特異度為97.96%。三者聯合預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的效能明顯高于三者單獨，提示多種生物標志物聯合對結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的預測價值更高。

綜上所述，結腸癌患者血清miR-335-5p 水平降低，而血清CEA、CA19-9 水平升高，三者水平變化與結腸癌腹腔鏡術后復發轉移有關。miR-335-5p、CEA、CA19-9 可作為預測結腸癌腹腔鏡術后復發轉移的血清生物學指標。