雷公藤紅素對脂多糖誘導膿毒癥大鼠ALI的影響及其機制

何招輝，楊春麗，楊小剛，黃翠蘭，郭經華

江西省人民醫院，南昌330006

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是導致重癥監護病房膿毒癥患者死亡的重要原因［1］。研究表明，膿毒癥早期即存在嚴重的全身炎癥反應，大量炎癥因子可使肺微血管內皮細胞屏障功能失衡，血管通透性增加，導致彌漫性肺間質水腫和肺泡水腫［2］。因此，炎癥反應是膿毒癥ALI/ARDS 發生、發展的關鍵環節。目前，對于膿毒癥ALI/ARDS 仍無特效治療方法，抑制早期劇烈的炎癥反應可能是一個值得探索的研究方向。雷公藤紅素是從傳統中藥雷公藤根部提取的一種醌甲基三萜類化合物，具有多種藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、免疫調節等。有研究報道，雷公藤紅素可通過調節炎癥信號通路、抑制炎癥因子產生和調節免疫細胞活性等發揮抗炎和免疫調節作用，對多種自身免疫性疾病和炎癥反應性疾病具有治療作用［3］。但目前鮮見雷公藤紅素治療膿毒癥相關ALI的報道。2018年1 月—2020 年12 月，本研究觀察了雷公藤紅素對脂多糖（LPS）誘導膿毒癥大鼠ALI的影響，并探討其作用機制，旨在為藥物治療膿毒癥相關ALI 提供新的思路。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD 大鼠18 只，6～8 周齡，體質量300～450 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0014。所有大鼠于獨立通風籠具內單籠飼養，飼養環境溫度24～26 ℃、相對濕度40%～60%，光照12 h 明暗交替，自由攝食和飲水。

雷公藤紅素，純度＞99%，CAS 號34157-83-0，購自武漢易泰科技有限公司上海分公司。LPS，購自美國Sigma 公司。GEM3500 血氣分析儀，購自美國IL 公司。DM2500P 偏光顯微鏡，購自美國LEICA 公司。HED-SY96S 酶標儀，購自山東霍爾德電子科技有限公司。大鼠TNF-α、IL-1β、細胞間黏附分子1（ICMA-1）、血管內皮細胞黏附分子1（VCAM-1）、核因子κB（NF-κB）ELISA試劑盒，購自江蘇綠葉生物科技有限公司。胞漿胞核蛋白提取試劑盒，購自美國Sigma公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性喂養3 d，按隨機數字表法隨機分為對照組、模型組、雷公藤紅素組，每組6 只。模型組和雷公藤紅素組經尾靜脈一次性注射LPS 5 mg/kg建立ALI模型。雷公藤紅素組同時經腹腔單次注射0.02%雷公藤紅素1 mg/kg，模型組同時經腹腔注射等量生理鹽水，對照組分別經尾靜脈和腹腔注射等量生理鹽水。注射完畢，常規飼養24 h。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準，并經江西省人民醫院動物倫理委員會審批（審批號：2019127）。

1.3 觀察指標

1.3.1 腹主動脈血氧分壓（PO2） 各組注射完畢，常規飼養24 h，經腹主動脈取血1 mL，采用GEM3500血氣分析儀檢測腹主動脈血PO2。

1.3.2 肺組織濕重干重比值（W/D） 腹主動脈取血后，腹腔注射20%烏拉坦過量麻醉致死，無菌條件下解剖胸腔，取左肺組織，用電子天平稱濕重（W），然后置于60 ℃烘箱烘干至恒重，再用電子天平稱干重（D），計算肺組織W/D。

1.3.3 肺組織病理觀察與肺損傷病理評分 取右肺下葉組織，置于4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，二甲苯脫蠟后，再經高濃度乙醇到低濃度乙醇，直至蒸餾水，最后HE 染色。光鏡下觀察肺組織病理改變，并行肺損傷病理評分。采用4項指標評估肺損傷程度：①肺泡充血；②肺泡出血；③肺泡間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；④肺泡間隔增厚和（或）透明膜形成。評分標準：無損傷記0分，輕度損傷記1分，中度損傷記2分，重度損傷記3分。各項評分的總和即為肺損傷病理評分［4］。

1.3.4 肺組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 含量 取右肺中上葉組織，置于組織勻漿器中，冰浴下勻漿，然后3 000 r/min離心10 min、離心半徑13.5 cm，留取上清液。采用ELISA 法檢測肺組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 含量。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.5 細胞核和細胞質內NF-κB 含量 取右肺下葉組織，RIPA 裂解液充分裂解，按胞漿胞核蛋白抽提試劑盒說明提取細胞質蛋白和細胞核蛋白。采用ELISA法檢測細胞核和細胞質內NF-κB含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料以±s表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey"s 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組腹主動脈血PO2、肺組織W/D、肺損傷情況比較 三組腹主動脈血PO2、肺組織W/D、肺損傷病理評分比較見表1。對照組鏡下可見肺泡結構清晰，肺泡壁光滑，肺泡內無液體和炎癥細胞浸潤。與對照組比較，模型組肺泡充血和出血明顯，并伴有大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構塌陷，輪廓不清。與模型組比較，雷公藤紅素組肺泡充血和出血明顯減輕，肺泡可見少量炎癥細胞浸潤，肺泡結構清晰可見。見圖1。

表1 各組腹主動脈血PO2、肺組織W/D、肺損傷病理評分比較（±s）

表1 各組腹主動脈血PO2、肺組織W/D、肺損傷病理評分比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組雷公藤紅素肺損傷病理評分（分）0.67±0.21 12.50±0.43*5.50±0.43*#n6 6 6腹主動脈血PO2（mmHg）99.17±5.83 61.67±2.77*72.00±2.44*#肺組織W/D 2.83±0.04 4.65±0.08*3.46±0.03*#

圖1 三組肺組織病理學變化（HE染色，40×）

2.2 三組肺組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB含量比較 見表2。

表2 三組肺組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB含量比較（ng/L，±s）

表2 三組肺組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB含量比較（ng/L，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組觀察組雷公藤紅素n6 6 6 TNF-α 24.50±1.89 281.20±5.38*139.50±6.33*#IL-1β 1.65±0.13 29.00±2.48*12.67±0.92*#ICAM-1 6.38±0.29 175.80±6.44*93.00±4.09*#VCAM-1 12.50±1.38 154.00±7.10*81.17±4.17*#NF-κB細胞核內400.00±10.41 702.20±15.64*536.20±10.23*#細胞質內404.70± 9.62 213.30± 9.14*346.80±13.77*#

3 討論

ALI/ARDS 是導致重癥監護病房膿毒癥患者死亡的重要原因［1］，其特征是失控的炎癥反應和肺泡上皮屏障、肺微血管內皮屏障損傷，導致肺泡毛細血管通透性增加，炎癥細胞浸潤，細胞因子和趨化因子大量釋放，繼而引起急性非心源性肺水腫［5-6］。因此，炎癥反應是ALI/ARDS 的本質。目前，膿毒癥ALI/ARDS 仍無特效治療方法，只能以肺保護性通氣策略、限制性液體復蘇等對癥支持治療［7］，而抑制早期劇烈的炎癥反應可能是一個值得探索的研究方向。

雷公藤紅素是從傳統中藥雷公藤根部提取的一種醌甲基三萜類化合物，因其具有高效低毒的抗腫瘤作用，最早在臨床上被廣泛用于腫瘤治療。后來研究發現，雷公藤紅素還具有抗炎、抗氧化、免疫調節等藥理活性［8］。在動物試驗中發現，雷公藤紅素能夠減輕小鼠氣道炎癥反應和ALI。如劉瑞麟等［9］研究認為，雷公藤紅素可通過調節成纖維細胞產生肺組織干細胞因子，抑制肥大細胞產生組胺和嗜酸性粒細胞趨化因子，從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應；王君濤等［10］經腹腔注射雷公藤紅素發現，小鼠鹽酸吸入性肺損傷明顯減輕。雷公藤紅素還可抑制炎癥因子引起的黏附分子表達以及對白細胞的黏附。低劑量雷公藤紅素能增加細胞間連接分子表達并抑制黏附分子表達，抑制內皮細胞黏附白細胞能力，具有抗炎癥反應作用［11］。雷公藤紅素能夠通過抑制NF-κB 信號通路抑制LPS 誘導的促炎癥細胞因子IL-6、IL-8、MCP-1 蛋白和mRNA 表達［12］。此外，雷公藤紅素還可通過抑制NF-κB 活化和TNF-α、IL-1β 表達，減輕炎癥反應，從而減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷［13］。由此推測，雷公藤紅素可能通過抑制NF-κB信號通路，發揮抑制炎癥反應的作用。

本研究結果發現，雷公藤紅素組腹主動脈血PO2較模型組明顯升高，肺組織W/D 較模型組明顯降低，表明雷公藤紅素可減輕大鼠ALI 時肺泡液體滲出，從而改善組織氧合。與模型組比較，雷公藤紅素組肺組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 含量明顯下降，肺組織細胞質和細胞核內NF-κB 含量均明顯升高。NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內的多向性轉錄因子，可參與人體的多種生物學過程，能夠調節多種細胞因子、黏附分子、趨化因子等基因表達［14］。NF-κB蛋白通常以同源或異源復合物的形式存在。細胞在靜息狀態下，細胞質中的p50/p65 與其抑制物IκB 結合形成三聚體，使其不能核易位。當細胞受到外源性信號刺激時，IκBα 被磷酸化后降解，而被釋放的p50/p65 則進行核易位，與基因上的IκB 位點特異性結合，發揮調節細胞功能的作用［15］。本研究發現，雷公藤紅素能夠抑制NF-κB 向核內轉位，同時發現TNF-α、IL-β、ICAM-1、VCAM-1 等炎癥因子分泌減少。因此推測，雷公藤紅素能夠抑制膿毒癥大鼠體內的炎癥反應，其作用機制可能是通過抑制NF-κB的核內轉位實現的。

綜上所述，雷公藤紅素能夠抑制LPS 誘導的膿毒癥大鼠ALI，其機制可能與抑制NF-κB 的核內轉位，從而抑制大鼠體內炎癥因子的含量有關。這為臨床治療膿毒癥ALI/ARDS提供了新的思路。