胰腺導管腺癌組織miR-196b、TGFβR1表達變化及其意義

范婧怡，王健

鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450003

胰腺癌是一種惡性程度很高的惡性腫瘤，患者預后極差，即使經積極治療，患者5年總體生存率仍低于10%［1］。導管腺癌是胰腺癌最常見的病理類型，占80%～90%。胰腺導管腺癌早期診斷較為困難，患者就診時多處于中晚期，治療效果不理想［2］。目前，胰腺導管腺癌的病因和發病機制尚不十分清楚。因此，深入探索胰腺導管腺癌發病的分子機制，對尋找腫瘤早期診斷的分子標志物具有重要臨床價值。微小RNA（miRNA）是一類無蛋白編碼功能的RNA 分子，可通過其發夾結構，調控下游基因表達，從而參與多種生物學過程。大量研究表明，miRNA在多種惡性腫瘤組織中表達失調，從而影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡［3-4］。miR-196b 基因定位于人染色體7p15.2，能夠參與下游靶基因的表達調控，如雷帕霉素靶蛋白，進而參與個體生長發育、脂肪細胞分化等生物學過程［5］。有研究報道，在腫瘤組織中miR-196b 表達上調，其表達上調能夠通過促進Fas 等原癌基因表達，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力［6］。轉化生長因子β 受體1（TGFβR1）基因定位于人染色體9q22.33，其編碼的TGFβR1蛋白與TGFβ 結合后活化，從而激活下游信號通路，繼而促進細胞的增殖、遷移。有研究報道，在人類腫瘤組織中TGFβR1 異常高表達［7］。此外，有學者報道TGFβR1 基因是miR-196b 新的作用靶點，miR-196b能在轉錄后水平促進TGFβR1 基因表達，從而促進腫瘤的惡性進展［8］。但目前鮮見胰腺導管腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達變化的報道。本研究觀察了胰腺導管腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達變化，并探討其表達變化與患者臨床病理特征的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年4 月—2020 年1 月鄭州大學第二附屬醫院收治的胰腺導管腺癌患者88例。納入標準：①經術后組織病理學檢查，符合胰腺導管腺癌診斷；②首次診斷；③接受胰腺癌根治性手術或姑息性手術治療；④病歷資料完整。排除標準：①合并急慢性胰腺炎者；②合并其他器官惡性腫瘤者；③合并心、肺、腎等重要臟器功能衰竭者。其中，男51 例、女37 例，年齡41～73（53.65 ± 6.8）歲；腫瘤直徑：≤2 cm 47 例，＞2 cm 41 例；腫瘤位置：胰頭部55 例，胰體尾部33 例；病理類型：腺癌59 例，腺鱗癌29 例；組織分化程度：高分化28 例，中低分化60 例；臨床分期［9］：Ⅰ期35 例，Ⅱ、Ⅲ期53 例；有淋巴結轉移48例，無淋巴結轉移40例。本研究經鄭州大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 miR-196b、TGFβR1 表達檢測 取手術切除的胰腺癌組織和癌旁正常組織各約100 mg，液氮下充分研磨，采用TRIzol 法提取組織總RNA，經NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測，提取的總RNA 濃度和純度合格。然后將總RNA 反轉錄為cDNA。反轉錄條件：25 ℃15 min，40 ℃2 h。以cDNA為模板進行PCR 擴增。miR-196b 上游引物5"-TAC?CATCCTAGACCAGCGTGAC-3"、下游引物5"-ACCT?GGCGGCACTCCTTA-3"，U6 上游引物5′-GCGCCTC?GAGATGCCTTG-3"、下游引物3"-CTGGAGCGTGC?GTGGA-5"；TGFβR1上游引物5"-ACGGCGTTACAGT?GTTTCTG-3"、下游引物 5"-GCACATACAAACG?GCCTATCTC-3"，GAPDH 上游引物5"-TTAGCACG?CATCGCATAATG-3"、下游引物5"-TGGCAATACCTTT?GTTGTCATC-3"。PCR 反應體系共20 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green Master Mix 10 μL，雙蒸水8 μL；反應條件：94 ℃3 min，94 ℃20 s、60 ℃30 s、70 ℃10 s 共40 個循環。所有操作在ABI 7500型實時熒光定量PCR儀上完成。采用2-ΔΔCT法計算miR-196b、TGFβR1相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson 線性相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織與癌旁正常組織miR-196b、TGFβR1 表達比較 胰腺癌組織與癌旁正常組織miR-196b相對表達量分別為3.422±0.331、1.772±0.213，TGFβR1 相對表達量分別為2.145 ± 0.317、0.927 ± 0.114。胰腺癌組織miR-196b、TGFβR1 相對表達量均高于癌旁正常組織（t分別為39.324、33.917，P均＜0.05）。

2.2 胰腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 胰腺癌組織miR-196b、TGFβR1表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 胰腺癌組織miR-196b 表達與TGFβR1 表達的關系 Pearson 線性相關分析顯示，胰腺癌組織miR-196b相對表達量與TGFβR1相對表達量呈正相關關系（r=0.610，P＜0.05）。

3 討論

胰腺導管腺癌是一種惡性程度非常高的消化系統腫瘤，其發病率和死亡率近年來呈明顯上升趨勢［10］。目前，外科手術仍然是胰腺導管腺癌最有效的治療手段，但其起病隱匿，進展迅速，多數患者首診時即已錯過了最佳手術時機。即使能夠接受外科手術，術后也易出現復發和轉移，患者預后較差［11］。目前，胰腺導管腺癌的病因和發病機制尚不清楚，普遍認為是一個多基因參與、多階段發展的復雜生物學過程，涉及原癌基因活化、抑癌基因功能缺失。深入探索胰腺導管腺癌發病的分子機制，將有助于胰腺導管腺癌的早期診斷和靶向治療。

miRNA 位于基因間區或內含子區域，在核內由RNA 聚合酶Ⅱ轉錄后進一步被切割產生具有莖環結構的前體miRNA，經Dicer 酶降解后成為成熟miRNA，加入到RNA 誘導的沉默復合物中，通過與靶基因mRNA 結合，從而調控靶基因mRNA 降解或阻遏其轉錄后翻譯。miRNA 表達失調能夠影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡，在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。miR-196b是miRNA 家族成員之一，基因定位于人染色體7p15.2，能夠在轉錄后水平調控其下游基因的表達，繼而參與機體的生長、發育等生物學過程。近年研究發現，miR-196b 在肝癌、胃癌等惡性腫瘤組織中表達上調，其表達上調能夠通過激活AKT 信號通路，促進下游血管內皮生長因子等癌基因的表達，導致腫瘤惡性進展［12］。本研究結果發現，胰腺癌組織miR-196b 表達上調，提示miR-196b 可能作為一種促癌基因參與胰腺導管腺癌的發生、發展。但目前miR-196b 在胰腺導管腺癌組織中表達上調的機制尚不明確，可能與其上游調控分子長鏈非編碼RNA（lncRNA）有關。有學者報道，lncRNA HOXA10 能夠結合miR-196b 基因的啟動子區，抑制miR-196b 表達，當細胞惡變后，lncRNA HOXA10基因啟動子區甲基化，導致lncRNA HOXA10表達降低、miR-196b表達升高，從而促進其下游癌基因的表達，繼而導致腫瘤惡性進展［13］。本研究結果亦發現，胰腺癌組織miR-196 表達與腫瘤組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關，表明miR-196b 表達上調能夠促進胰腺導管腺癌進展，其機制可能與miR-196b 能夠促進其下游靶基因（如GATA6）表達有關。GATA6是miR-196b的直接作用靶點，可抑制細胞的增殖和遷移能力，而miR-196b高表達能夠降低GATA6 mRNA 的穩定性，從而抑制GATA6的抑癌作用［14］。

腫瘤的發生、發展過程中存在多條信號傳導通路過度活化現象，其中TGFβ 信號傳導通路激活在腫瘤的發生、發展中具有重要作用。TGFβR1 是TGFβ 信號傳導通路的關鍵受體之一，位于細胞表面，在與腫瘤微環境中的TGFβ 結合后，通過經典和非經典激活途徑，促進SMAD 等轉錄因子活化，從而影響其下游靶基因的表達。在生理狀態下，TGFβR1 能夠參與細胞正常的增殖和遷移等生物學過程，但在腫瘤發生時TGFβR1激活，促進了腫瘤細胞侵襲和遷移。本研究結果發現，胰腺癌組織TGFβR1表達升高，提示TGFβR1可能參與胰腺導管腺癌的發生、發展，其原因與調控TGFβR1表達的基因異常有關。有研究報道，腫瘤發生時具有靶向抑制TGFβR1 表達功能的miR-142-3p 表達降低，進而引起TGFβ 下游通路的過度活化［15］。本研究結果還發現，胰腺癌組織TGFβR1 表達與腫瘤組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關，提示TGFβR1能夠參與胰腺導管腺癌進展，其機制與TGFβR1 能夠參與調控上皮間質轉化相關基因的表達有關。有研究報道，TGFβR1 活化能夠促進Snail1、Twist 等轉錄因子表達，導致上皮標志物E-鈣黏素表達降低，而間充質標志物波形蛋白表達升高，引起細胞上皮間質轉化，導致腫瘤易發生局部浸潤和遠處轉移［16］。

本研究結果還發現，胰腺癌組織miR-196b 表達與TGFβR1 表達呈正相關關系。目前miR-196b 與TGFβR1 在胰腺導管腺癌中相互作用的機制尚不清楚，可能與miR-196b 能夠增強TGFβR1 表達有關。有研究表明，miR-10b、miR-346 等多種miRNA 能夠與靶基因的5′端非編碼區結合，并通過與翻譯調控元件相互作用，從而激活靶基因的表達［17］。此外，有研究還發現，腫瘤微環境中TGFβ 表達升高，并通過結合腫瘤細胞表面的TGFβR1，誘導miR-196b 表達上調，進而影響上皮間質轉化的關鍵轉錄因子表達，從而促進腫瘤惡性轉化［18］。

綜上所述，胰腺導管腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達上調，二者可能協同參與胰腺導管腺癌的發生、發展。