先天性巨結腸癥患兒病變結腸組織GAP-43、MEF2表達變化及其意義

任傳濤，楊洪超，武靖華，李愛武

1 德州市人民醫院，山東德州253000；2 山東大學臨床學院；3 山東大學齊魯醫院

先天性巨結腸癥（HD）又稱腸管無神經節細胞癥，是小兒消化道發育畸形中的常見疾病之一［1］。目前，HD 的病因尚不明確，一般認為是由腸神經系統發育缺陷引起的［2］。有研究報道，多種參與腸神經系統分化、發育和突觸形成的蛋白在HD 病變結腸組織中表達異常，這些異常表達的蛋白可能在HD 發生、發展中起重要作用，但其具體機制尚不清楚［3］。生長相關蛋白43（GAP-43）是一種存在于神經突觸前末端的生長相關蛋白，與神經突觸生長、神經系統發育以及神經再生關系密切［4］。肌細胞增強因子2（MEF2）是一種調控肌肉形成和發育的核轉錄因子，在肌肉組織中廣泛表達。近年研究發現，MEF2 在神經系統中亦大量存在，具有調控突觸形成和神經元成熟等生物學功能［5］。有研究認為，GAP-43、MEF2異常表達可能與包括HD在內的腸神經系統疾病密切相關［6-7］。但目前國內外關于HD 患兒病變組織GAP-43、MEF2 表達變化的報道較少。為此，本研究觀察了HD患兒病變結腸組織GAP-43、MEF2表達變化，并探討其臨床意義?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月—2020 年1 月德州市人民醫院收治的HD患兒41例（觀察組）。所有患兒符合《新生兒先天性巨結腸的診斷與治療》［8］中的診斷標準，并經術后組織病理學檢查明確診斷。納入標準：①符合HD 診斷標準；②接受巨結腸切除手術；③術前未接受任何治療。排除標準：①合并其他消化道畸形者；②非足月患兒。其中，男32例、女9 例，年齡（1.58 ± 0.44）歲。本研究經德州市人民醫院醫學倫理委員會批準，所有患兒監護人知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 GAP-43、MEF2 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取手術切除的結腸組織，液氮速凍后轉運至-80 ℃冰箱保存。選取痙攣段無神經節細胞的結腸組織（病變結腸組織）、近端擴張段有神經節細胞的結腸組織（正常結腸組織）各約100 mg，采用TRIzol 法提取組織總RNA，經UV1901 型紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.7～2.0，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA 完整，可用于后續實驗。分別取總RNA 1 μg，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit 說明將總RNA 反轉錄為cDNA。反轉錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix EX TaqTMⅡ試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：GAP-43 上游引物5"-CTGACCAAGAACATGCCT?GA-3"，下游引物5"-GGGACTTCAGAGTGGAGCTG-3"；MEF2 上 游 引 物5"-CCGACTGCCTACAACACT?GA-3"，下游引物5"-GATAACTGCCCTCCAGCAAC-3"；β-actin 上 游 引 物5"-AGACCTGTACGCCAACA?CAG-3"，下游引物5"-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3"。PCR 反應體系共25 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，無酶水8.5 μL；反應條件：95 ℃變性12 s，55 ℃退火12 s，72 ℃延伸15 s，共45 個循環。以β-actin 為內參，采用2-ΔΔCT法計算GAP-43、MEF2 mRNA 相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 GAP-43、MEF2蛋白表達檢測 ①采用Western blotting 法。取病變結腸組織和正常結腸組織各約100 mg，液氮下研磨成粉末，組織裂解液充分裂解，離心提取組織總蛋白。經BCA 法蛋白定量合格后，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白約30 μg，SDS-PAGE 分離蛋白。電泳結束，將蛋白電泳產物電轉印至PVDF 膜。然后將PVDF 膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入GAP-43（稀釋比為1∶1 000）、MEF2（稀釋比為1∶1 000）、GAPDH（稀釋比為1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的IgG 二抗（稀釋比為1∶1 000），室溫孵育1 h，ECL發光，暗室中曝光、顯影。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②免疫組化法。取新鮮的病變結腸組織和正常結腸組織，10%中性甲醛固定24 h，常規脫水、透明和石蠟包埋，4 μm 厚連續切片。切片常規脫蠟、水化，微波修復抗原，室溫下孵育10 min，分別加入鼠抗人GAP-43、MEF2多克隆抗體，室溫孵育過夜。次日，再滴加相應的二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對照。采用雙盲法由兩位經驗豐富的病理科醫師獨立閱片，結果不一致時協商統一。GAP-43、MEF2 陽性染色定位于細胞質或細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。以染色強度和陽性細胞比例綜合評價。染色強度評分標準：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例評分標準：＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2 分，50%～＞75%記為3 分，75%以上為4 分。兩項評分相加＞2分為陽性表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Spearman 相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病變結腸組織與正常結腸組織GAP-43、MEF2表達比較 見表1。

2.2 病變結腸組織與正常結腸組織免疫組化染色結果 光鏡下，病變結腸組織與正常結腸組織黏膜下肌層和肌間神經細胞均可見GAP-43、MEF2 陽性表達，病變結腸組織GAP-43、MEF2 陽性染色較少，而正常結腸組織陽性染色較多，見圖1。病變結腸組織與正常結腸組織GAP-43 陽性表達率分別為29.27%（12/41）、73.17%（30/41），MEF2 陽性表達率分別為24.39%（10/41）、63.41%（26/41）。病變結腸組織GAP-43、MEF2 陽性表達率均低于正常結腸組織（P均＜0.05）。

表1 病變結腸組織與正常結腸組織GAP-43、MEF2 mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

表1 病變結腸組織與正常結腸組織GAP-43、MEF2 mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常結腸組織比較，*P＜0.05。

組織類型n GAP-43 MEF2病變結腸組織正常結腸組織蛋白0.34±0.09*0.44±0.12 41 41 mRNA 0.70±0.25*0.94±0.33蛋白1.68±0.49*2.24±0.46 mRNA 0.05±0.01*0.13±0.04

圖1 病變結腸組織與正常結腸組織GAP-43、MEF2陽性染色情況（免疫組化染色，100×）

2.3 病變結腸組織GAP-43 表達與MEF2 表達的關系 Spearman 相關分析顯示，病變結腸組織GAP-43 mRNA 相對表達量與MEF2 mRNA 相對表達量呈正相關關系（r=0.634，P＜0.05），GAP-43蛋白相對表達量與MEF2 蛋白相對表達量亦呈正相關關系（r=0.543，P＜0.05）。

3 討論

HD 是一種比較常見的先天性腸神經系統發育畸形，在新生兒中的發病率為0.02%～0.05%，并且存在性別差異，男女之比約為4∶1。如果不及時治療，易在新生兒期并發小腸炎，嚴重者常常因中毒性休克而死亡［9-10］。HD最基本的病理變化是病變腸段肌肉和黏膜下層神經節細胞缺如。消化道腸管內神經節細胞是由外胚層的神經嵴細胞發育而來，在胚胎期6～12 周，神經嵴細胞沿頭尾向消化道壁移行形成神經節，且分化成不同亞型進入腸道神經元。腸道神經元的生存依賴于腸道演化過程中所提供的微環境，當微環境發生改變時，神經嵴細胞移行停頓，神經節生成受限，無神經細胞節段延長［11］。目前，造成腸道神經元發育停頓的機制尚不明確，可能是由多個基因的累加效應引起的［12］。

GAP-43是目前研究較多的一類神經營養因子，在促進神經突觸生長、神經系統發育以及神經再生等方面具有重要作用。有研究報道，腸神經系統中GAP-43表達降低時，其傳遞的腸神經系統抑制性神經遞質相應減少，從而引起抑制性神經減弱、興奮性神經增強，導致腸管收縮增強，從而引起HD［13-14］。此外，腸道蠕動依賴神經細胞與平滑肌細胞的連接，突觸則是兩者連接的根本結構，而腸神經系統中存在大量的突觸，故突觸異常也是導致腸道功能障礙的重要因素。畢佳琦等［15］研究發現，上調突觸可塑性相關蛋白GAP-43 表達，能夠激活PI3K/PTEN/AKT 信號途徑，促進大鼠腸道突觸修復，由此認為GAP-43低表達可導致抑制性神經遞質減少，神經分化受限、突觸結構異常，繼而導致神經與腸壁的連接受限，神經化學信號傳導異常，從而導致HD 的發生。本研究結果發現，病變結腸組織GAP-43 mRNA和蛋白表達均低于正常結腸組織，提示GAP-43低表達能夠促進HD的發生、發展。

MEF2 為MDAS-box 轉錄因子家族中的一種轉錄調節因子，在脊椎動物中含有4 種亞型：MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。 MEF2 可 通 過 激 活MAPK、PKC 等多條信號通路對細胞增殖和分化進行調節［16］。以往對MEF2 的研究多圍繞生肌過程，在骨骼肌、心肌、平滑肌的發育過程中介導細胞的分化。近年研究發現，MEF2 在神經系統發育過程中亦具有重要作用，特別是在中樞神經系統的神經細胞中，MEF2的4種類型均高表達［17］。雷頡等［18］研究發現，MEF2C 在膠質母細胞瘤中高表達，故認為MEF2 可能與神經細胞的功能或分化程度密切相關。本研究結果發現，病變結腸組織MEF2 mRNA和蛋白表達均低于正常結腸組織，提示MEF2 低表達能夠促進HD的發生、發展。

GAP-43、MEF2在神經發育過程中均具有重要作用。本研究在HD患兒病變結腸組織中發現GAP-43、MEF2 均陽性表達，并且病變結腸組織GAP-43、MEF2 陽性表達率均低于正常結腸組織。筆者認為GAP-43、MEF2 表達降低可導致神經嵴細胞沿消化道壁移行受阻，從而促進了HD 的發生［19］。Spear?man 相關分析顯示，病變結腸組織GAP-43 mRNA 和蛋白相對表達量與MEF2 mRNA 和蛋白相對表達量均呈正相關關系，提示GAP-43、MEF2可能共同參與HD的發病過程。

綜上所述，HD 患兒病變結腸組織GAP-43、MEF2 低表達，并且二者表達呈正相關關系，二者可能共同參與HD 的發病過程。但由于本研究樣本量較小，也沒有直接證實GAP-43、MEF2與神經信號傳導的關系，故其結論仍需進一步驗證。