海巴戟果提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦副溶血性弧菌的抑制效應(yīng)

常逢彤，馮謙潔，黎 娜，周海龍

（海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)與藥學(xué)院 海口 570228）

海巴戟（Morinda citrifoliaLinn）為茜草科（Rubiaceae）巴戟天屬（Morinda）植物，國(guó)外稱之為諾麗（Noni）[1]，廣泛種植于太平洋地區(qū)，作為保健及藥用植物已有上千年的歷史[2]，其果實(shí)、葉子、枝干、根部均可入藥[3]，在我國(guó)海南島、西沙群島和臺(tái)灣島也有分布。海巴戟各部位提取物均具有一定的抗菌、抑瘤等作用[4?5]，其果實(shí)提取物是安全的天然抗氧化劑，具有抗氧化活性[6]、保護(hù)心肌細(xì)胞[7]和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，葉子提取物可用于治療潰瘍和輕微感染[8]。海巴戟的根、葉、果均含有抗氧化活性成分，且根的抗氧化活性最強(qiáng)[9]。海巴戟果汁對(duì)四氯化碳（CCl4）引起的肝損傷小鼠具有肝保護(hù)功能[10]。有研究表明，關(guān)節(jié)病患者攝入海巴戟果汁可以控制炎癥，緩解關(guān)節(jié)不適，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[11]。由于海巴戟富含多種活性成分，國(guó)際市場(chǎng)已將它定位為藥品和保健食品[12]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科（Vibrionaceae）、弧菌屬（Vibrio），無(wú)芽胞，有鞭毛，形態(tài)呈桿狀、弧狀、卵圓狀等。該菌在含2%～4%氯化鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，在氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2%時(shí)基本不生長(zhǎng)。副溶血性弧菌的致病性是溶血素、脲酶、黏附因子和分泌系統(tǒng)等多種致病因子相互作用的結(jié)果，機(jī)理較復(fù)雜。其主要致病因子是多種溶血毒素，主要有不耐熱溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)，耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)和相對(duì)耐熱直接溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)[13]。副溶血性弧菌常存在于海洋和河口生態(tài)系統(tǒng)及魚(yú)、蝦、貝類等水產(chǎn)品中[14]。凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)又稱南美白對(duì)蝦，由于凡納濱對(duì)蝦具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力、生長(zhǎng)快和抗病力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點(diǎn)，是目前世界上養(yǎng)殖單產(chǎn)最高的對(duì)蝦品種[15]，也是世界三大高產(chǎn)量對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一[16]。隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)蝦養(yǎng)殖病害發(fā)生頻率亦相應(yīng)增加，由副溶血性弧菌引起的疾病最常見(jiàn)，如紅體病、紅腿病、白斑病、腸炎病、爛鰓病等，導(dǎo)致對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大損失。近年來(lái)，急性肝胰腺壞死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND）在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中廣為流行，患病對(duì)蝦表現(xiàn)為紅體、殼軟，腸胃排空，肝胰腺變色、腫大后呈纖維化萎縮，最終壞死。該病3～5 d 致死率高達(dá)90%[17]。我國(guó)于2010 年在海南省首次發(fā)現(xiàn)該疾病，隨后全國(guó)大部分對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)遭受感染，損失慘重。2012 年，LIGHTNER 等[18]首先報(bào)了AHPND 的致病原是副溶血弧菌，隨后，又有多篇報(bào)道證明AHPND 是由副溶血弧菌引起[19?23]，通過(guò)控制副溶血性弧菌可以大大減少AHPND 暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[24]。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)副溶血性弧菌的防治主要依賴抗生素，但抗生素的長(zhǎng)期使用使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)，多種副溶血性弧菌菌株已產(chǎn)生光譜耐藥性。相關(guān)研究表明，副溶血性弧菌已對(duì)磺胺類、頭孢類、氨基糖苷類和青霉素類藥物出現(xiàn)不同程度的耐藥性，對(duì)阿莫西林的平均耐藥率已高達(dá)50%[25?27]。因此，尋找一種有效的天然抗菌物質(zhì)已成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，植物提取物中的生物堿、萜類、單寧、皂苷、糖苷、黃酮類、酚類、甾體和精油等具有促進(jìn)生長(zhǎng)、改善免疫系統(tǒng)、抗菌能力、刺激食欲和抗應(yīng)激特性等特性[28?30]。使用植物提取物作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素可持續(xù)有效的替代品，具有治療成本低、生物降解性好、耐藥性低等優(yōu)點(diǎn)[31?34]。本研究針對(duì)副溶血性弧菌對(duì)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重危害性，以海巴戟為材料，探究其提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦副溶血性弧菌的抑制效果，旨在為海巴戟在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料海巴戟果購(gòu)于海口某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為中國(guó)科學(xué)院海洋研究所分離株。

1.2 海巴戟熱水提取物的制備采用傳統(tǒng)煎煮法[35]對(duì)海巴戟果有效成分進(jìn)行提取。取30 g 曬干的成熟海巴戟果，粉碎機(jī)粉碎后，加300 mL 水，浸泡30 min 后加熱煮沸5 min（先文火后武火，期間邊煮邊攪拌），4 層紗布過(guò)濾，濾渣再加100 mL 水，直接加熱煮沸5 min，4 層紗布過(guò)濾，合并2 次所得濾液。將合并后的濾液濃縮至30 mL，此時(shí)海巴戟果熱水提取液終質(zhì)量濃度為1 g·mL?1。將得到的提取物經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，15 min）后分裝于EP 管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 副溶血性弧菌菌液的制備用滅菌接種環(huán)將副溶血性弧菌劃線接種與TCBS 瓊脂平板上，于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h；挑取單個(gè)菌落接種于5 mL TCBS 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r·min?1搖床培養(yǎng)12 h 后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋，至菌液終密度為1.0×107cfu·mL?1，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 濾紙片法測(cè)定紫外線對(duì)海巴戟果提取物抑菌能力的影響取海巴戟果提取物原液15 mL 至于滅菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行紫外燈照射，照射時(shí)長(zhǎng)分別為0、5、10、15、20、25 min，將副溶血性弧菌作為指示菌，取10 μL海巴戟果提取物原液吸附與滅菌濾紙片上，用無(wú)菌鑷子置于含菌平板表面。平板置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12～16 h，觀察并采用十字測(cè)量法記錄抑菌圈直徑。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)平板放置3 片濾紙，抑菌圈直徑取平均值。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定采用中藥抗菌實(shí)驗(yàn)試管二倍稀釋法[36]測(cè)定海巴戟果提取物的MIC 和MBC。取13 支無(wú)菌試管依次編號(hào)，1 號(hào)試管加9 mL TCBS 液體培養(yǎng)基，其余12 支試管，每管加5 mL。移液槍吸取濃度為1 g·mL?1的海巴戟果提取物2 mL，加入1 號(hào)試管中混勻；從1 號(hào)試管中取5 mL 加入2 號(hào)試管搖勻，如此依次倍比稀釋直至11 號(hào)試管，最后從11 號(hào)試管中吸取5 mL 棄去。至此，1～12 號(hào)試管中海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0 g·L?1，12 號(hào)試管為對(duì)照。在1～12 號(hào)試管中分別加入密度為1.0×107cfu·mL?1的菌液0.2 mL 并混勻，13 號(hào)試管不加菌液，為空白對(duì)照。將13 支試管放入30 ℃，180 r·min?1搖床培養(yǎng)12～16 h，根據(jù)試管內(nèi)液體的混濁程度判定海巴戟果提取物的MIC 值（無(wú)菌液生長(zhǎng)，液體澄清）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，試管內(nèi)依舊澄清的最小濃度為其MBC 值。

分別取上述培養(yǎng)12～16 h 和培養(yǎng)48 h 的試管內(nèi)液體，采用涂布平板的方法[37]對(duì)海巴戟果提取物的MIC 和MBC 值進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.6 煮沸時(shí)長(zhǎng)對(duì)海巴戟果提取物抑菌作用的影響取海巴戟果，分別煮沸0、5、10、15、20、25 min，4 層紗布過(guò)濾，將得到的濾液經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，15 min）后分別裝與EP 管中，4 ℃保存，備用。

取7 支試管，對(duì)照組編號(hào)為0，其余6 支依次編號(hào)為1～6，0～6 號(hào)試管中分別加入10 mL TCBS 培養(yǎng)基，1～6 號(hào)試管分別加煮沸0、5、10、15、20、25 min 的海巴戟果提取物3 mL，7 支試管分別接種5 μL 副溶血性弧菌，搖床培養(yǎng)（30 ℃，180 r·min?1）12～16 h。另準(zhǔn)備7 支試管，分別取0～6 號(hào)試管中的菌液1 mL，加9 mL PBS 緩沖液，得到稀釋液A0～A6，接著分別取A0～A6 試管中的菌液1 mL，加9 mL PBS 緩沖液，得到稀釋液B0～B6。

制板，分別取B0～B6 試管中的菌液5 μL，在培養(yǎng)皿上涂布均勻，每支試管設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，對(duì)各個(gè)培養(yǎng)皿分別計(jì)數(shù)并通過(guò)以下公式計(jì)算抑菌率（%）。

抑菌率=（對(duì)照皿菌落數(shù)?試驗(yàn)皿菌落數(shù)）/對(duì)照皿菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線對(duì)海巴戟果提取物抑菌能力的影響通過(guò)控制紫外燈照射時(shí)長(zhǎng)，對(duì)分別照射0、5、10、15、20、25 min 的海巴戟果提取物進(jìn)行涂布平板抑菌試驗(yàn)，對(duì)應(yīng)的抑菌圈平均直徑分別為11.2、8.4、8.0、6.7、0、0 mm。

根據(jù)平均值繪制折線圖（圖1）。從圖1 可知，紫外線會(huì)影響海巴戟果提取物的抑菌能力，紫外照射時(shí)間越長(zhǎng)，抑菌能力越弱；當(dāng)紫外線作用時(shí)間≥20 min 時(shí)，培養(yǎng)皿中濾紙片周圍無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫外線照射會(huì)影響海巴戟果提取物的抑菌效果，紫外照射時(shí)間越長(zhǎng)，抑菌能力越弱甚至消失。推測(cè)紫外線照射可能會(huì)分解海巴戟果提取物中的活性物質(zhì)，從而對(duì)其抑菌能力造成影響。

2.2 煮沸時(shí)長(zhǎng)對(duì)海巴戟果提取物抑菌作用的影響從圖2 可知，浸泡30 min（0 組）和對(duì)照組之間差異不顯著，煮沸5 min 和浸泡30 min 相比差異顯著，但是和煮沸10 min 差異不顯著。分別煮沸15、20、25 min和煮沸5、10 min 相比差異極顯著，但是三者之間差異不顯著。煮沸0、5、10、15、20、25 min 的海巴戟果提取物對(duì)副溶血性弧菌的抑菌率分別為12.64%、45.76%、48.64%、71.68%、71.36%、70.88%（表1）。煮沸能夠顯著提高海巴戟果提取物對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別煮沸0、5、10、15 min 時(shí)，海巴戟果提取物的抑菌率依次增大，15 min 后，煮沸時(shí)長(zhǎng)對(duì)其抑菌作用的幾乎沒(méi)有影響。煮沸15 min 的海巴戟果提取物抑菌效率最大。

圖1 紫外線照射時(shí)長(zhǎng)處理的海巴戟果提取液對(duì)副溶血性弧菌抑菌效果的影響Fig.1 Effect of the hot-water noni fruit extract under different ultraviolet exposure durations on bacteriostasis of V.parahaemolyticus

圖2 不同煮沸時(shí)長(zhǎng)海巴戟果提取物對(duì)副溶血性弧菌菌落數(shù)的影響數(shù)據(jù)柱（點(diǎn)）標(biāo)注相同字母表示差異不顯著（P > 0.01），不同字母表示差異顯著（P < 0.01）。Fig.2 Inhibition of number of colonies of V.parahaemolyticus by the hot-water noni fruit extract at different boiling durations Value columns (points) with the same letters mean significant difference at P > 0.01, while those with different letters mean significant difference at P < 0.01.

2.3 海巴戟果提取物MIC 值和MBC 值添加不同質(zhì)量濃度的海巴戟果提取物，培養(yǎng)12 h 后，1～13 支試管中，4～12 號(hào)試管內(nèi)液體混濁，1～3 號(hào)試管內(nèi)液體澄清，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，3 號(hào)試管出現(xiàn)輕微混濁，1～2 號(hào)試管內(nèi)液體依舊澄清，該結(jié)果初步表明，副溶血性弧菌的生長(zhǎng)在海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到25.00 g·L?1時(shí)明顯受到抑制，當(dāng)海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到50 g·L?1時(shí)，副溶血性弧菌不生長(zhǎng)。準(zhǔn)備副溶血性弧菌培養(yǎng)皿，分別對(duì)培養(yǎng)12 h 和48 h 的試管內(nèi)菌液進(jìn)行涂布培養(yǎng)，如表2、表3 所示，培養(yǎng)12 h后，海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度≥25.00 g·L?1時(shí)，培養(yǎng)皿中沒(méi)有副溶血性弧菌，據(jù)此判斷，海巴戟果提取物的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）值為25.00 g·L?1。繼續(xù)培養(yǎng)36 h 后，海巴戟果提取物質(zhì)量濃度為25.00 g·L?1的培養(yǎng)皿中出現(xiàn)副溶血性弧菌，而海巴戟果提取物質(zhì)量濃度為50.00 g·L?1和100 g·L?1的培養(yǎng)皿中仍沒(méi)有副溶血性弧菌生長(zhǎng)，據(jù)此得出其MBC 值為50.00 g·L?1。

表1 不同煮沸時(shí)間對(duì)海巴戟果提取物抑菌率的影響Tab.1 Effect of hot-water noni fruit extract on bacteriostatic rate at different boiling time

表2 添加不同質(zhì)量濃度海巴戟果提取物培養(yǎng)12 h 后副溶血性弧菌生長(zhǎng)情況Tab.2 The growth of V.parahaemolyticus after 12 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract

表3 添加不同質(zhì)量濃度海巴戟果提取物培養(yǎng)48 h 后副溶血性弧菌生長(zhǎng)情況Tab.3 The growth of V.parahaemolyticus after 48 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract

3 討 論

紫外線照射會(huì)影響海巴戟果提取物的抑菌能力，當(dāng)紫外線照射時(shí)間≥15 min 時(shí)，其提取物失去抑菌作用。凡納濱對(duì)蝦的人工養(yǎng)殖大都采用露天養(yǎng)殖場(chǎng)，向養(yǎng)殖池中添加海巴戟果提取物時(shí)，應(yīng)避開(kāi)紫外線較強(qiáng)的時(shí)候，因此，最好早晚補(bǔ)給，尤其是在紫外線較強(qiáng)的海南省，以免影響其抑菌作用的發(fā)揮。中藥材多為植物或動(dòng)物的干燥組織，或者是礦物類，動(dòng)、植物其細(xì)胞干枯萎縮，藥物有效成份結(jié)晶或定形沉淀存在于細(xì)胞內(nèi)，組織外表也變的緊密，使水分不易滲入和溶出。海巴戟果質(zhì)地較重，其細(xì)胞干枯萎縮，藥物有效成分結(jié)晶或定形沉淀存在于細(xì)胞內(nèi)，組織外表也變得緊密，簡(jiǎn)單的浸泡無(wú)法獲得其有效成分，煮沸時(shí)間也要≥15 min，才能使其更好地發(fā)揮藥效。海巴戟果提取物抑制副溶血性弧菌的MIC 為25 g·L?1，MBC 為50 g·L?1。

據(jù)研究，采用有機(jī)溶劑無(wú)水乙醇獲得的花椒籽和大蒜提取物對(duì)副溶血性弧菌也具有抑制作用，MIC 分別為12.50 g·L?1和18.25 g·L?1[38?39]。與之相比，海巴戟果熱水提取液對(duì)副溶血性弧菌的MIC 為25.00 g·L?1，高于花椒籽和大蒜提取物。但從制備方法上考慮，本研究采用的熱水煮沸方法簡(jiǎn)單易行，與有機(jī)溶劑相比，成本較低，能夠降低凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中對(duì)副溶血性弧菌的防治成本，提高養(yǎng)殖利潤(rùn)。

溫度升高均不利于花椒籽提取物和大蒜提取物抑菌效果的發(fā)揮，花椒籽提取物適宜溫度范圍為20～40 ℃；大蒜提取物在溫度高于50 ℃時(shí)易被氧化[38?39]。相比之下，海巴戟果熱水提取液因其制備條件，避免了高溫對(duì)其抑菌效果的影響。紫外線照射也會(huì)使花椒籽和大蒜提取物抑菌能力減弱[38?39]，這一結(jié)果與本研究相同。

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水域環(huán)境趨于惡化，各類細(xì)菌病和病毒病頻繁發(fā)生，給養(yǎng)殖者帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在大力倡導(dǎo)健康養(yǎng)殖、保證畜禽產(chǎn)品安全、保障人類健康的今天，海巴戟果提取液被證明對(duì)副溶血性弧菌有抑制作用，該結(jié)果為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域防治副溶血性弧菌病提供了依據(jù)。