海南島鳥(niǎo)巢蕨自然種群遺傳多樣性SRAP 分析

侯祥文，徐詩(shī)濤，王德立，梁靖雯，司更花

（1.海南大學(xué) 林學(xué)院，海口 570228; 2.海南大學(xué) 園藝學(xué)院，海口 570228;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所，海口 570311）

鳥(niǎo)巢蕨(Asplenium nidus)是鐵角蕨科Aspleniaceae 巢蕨屬的一個(gè)種，又名山蘇花，是熱帶雨林大型附生植物[1]。原生于亞洲東南部、澳大利亞?wèn)|部、印度尼西亞、印度和非洲東部等地[2?3]。《中國(guó)植物志》記載我國(guó)有鳥(niǎo)巢蕨分布于臺(tái)灣、福建、香港、廣東、廣西、海南、湖南、四川、貴州、云南和西藏等省份和地區(qū)。鳥(niǎo)巢蕨植物不僅可以豐富森林生物多樣性，還可調(diào)節(jié)森林生態(tài)系統(tǒng)的水分與養(yǎng)分循環(huán)，且具有藥用、食用與園林綠化價(jià)值。近年來(lái)，由于人為活動(dòng)干擾，野生鳥(niǎo)巢蕨被大量采集，生境縮小且破碎化嚴(yán)重，導(dǎo)致其遺傳多樣性降低。加上種間雜交嚴(yán)重，導(dǎo)致遺傳背景錯(cuò)綜復(fù)雜，已影響到其品種改良、新品種培育、保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用。因此，加強(qiáng)對(duì)鳥(niǎo)巢蕨遺傳多樣性與進(jìn)化研究對(duì)鳥(niǎo)巢蕨種質(zhì)資源保護(hù)和利用以及育種和遺傳改良具有重要意義。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性的簡(jiǎn)稱(chēng)，利用雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFS(Open Reading Frames，開(kāi)放閱讀框)進(jìn)行區(qū)域擴(kuò)增是該技術(shù)特點(diǎn)，因不同物種內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)的長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[4?6]。SRAP 技術(shù)具有操作方便、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、易于測(cè)序、速度快和成本低等特性，被廣泛運(yùn)用于動(dòng)物、植物、微生物的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測(cè)、基因定位和比較基因組學(xué)等研究[7?8]。SRAP 標(biāo)記通過(guò)直接分析遺傳物質(zhì)多態(tài)性作為不同種群劃分依據(jù)更為可行和客觀，能夠較好地開(kāi)展遺傳多樣性分析，可避免因季節(jié)性生理生化差異和不同發(fā)育階段而影響指標(biāo)的準(zhǔn)確性[9?10]。因此，可通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)分析鳥(niǎo)巢蕨親緣關(guān)系，得到更加科學(xué)和穩(wěn)定的分析結(jié)果。海南島是鳥(niǎo)巢蕨分布中心之一[11?12]，野生種群集中分布于霸王嶺、俄賢嶺、黎母山和五指山等熱帶雨林區(qū)域。不同種群間的鳥(niǎo)巢蕨在葉形、株高、孢子量、巢基大小方面存在一定差異[13?14]。為揭示鳥(niǎo)巢蕨自然種群狀況，促進(jìn)野生鳥(niǎo)巢蕨資源有效保護(hù)和利用，本研究采用SRAP 標(biāo)記技術(shù)，對(duì)海南島霸王嶺、俄賢嶺、黎母山和五指山6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨自然種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在探明海南島鳥(niǎo)巢蕨種群之間遺傳關(guān)系、親緣關(guān)系，進(jìn)而揭示海南島不同地理環(huán)境對(duì)鳥(niǎo)巢蕨遺傳多樣性及種群分化的影響，為鳥(niǎo)巢蕨保育和遺傳資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料于2011 年5 月?8 月及2019 年3 月?4 月，在海南島霸王嶺、俄賢嶺、黎母山及五指山6 個(gè)自然種群進(jìn)行采樣，每個(gè)種群范圍均>2 km2，6 個(gè)自然種群相互間地理距離>10 km。每個(gè)采集種群內(nèi)采樣個(gè)體間間隔距離>1 m。共采集96 份植株葉片樣本，硅膠干燥后，帶回實(shí)驗(yàn)室，提取DNA。各種群地理位置、生境及采樣個(gè)體數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 海南島鳥(niǎo)巢蕨6 個(gè)研究種群的地理位置與生境Tab.1 Location, habitat, and sample size of the 6 populations of Asplenium nidus in Hainan Island

1.2 DNA 提取采用北京天根生物有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA 提取試劑盒（DP305）提取鳥(niǎo)巢蕨葉片DNA，用w=1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，圖1 為鳥(niǎo)巢蕨種群基因組DNA 電泳圖。提取樣品基因組DNA 用核酸微量測(cè)定儀稀釋至一致的質(zhì)量濃度（50 mg·L?1），置于?20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SRAP 擴(kuò)增與檢測(cè)分析根據(jù)LI 等[15]的方法，設(shè)計(jì)正向引物17 個(gè)，反向引物20 個(gè)，由北京三博生物技術(shù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)使用TC-512PCR 儀（Techne，Ltd.）。PCR 擴(kuò)增體系：1U 的TaqDNA 酶，1.5 mmol·L?1的Mg2+，0.20 mmol·L?1的dNTP(Fermentas Biotec.)和25 ng 的DNA，0.5 μmol·L?1的引物。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 sec，52 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存[16]。擴(kuò)增產(chǎn)物在w=6%變性聚丙烯酰胺凝膠上（65 w 恒定功率）電泳2～2.5 h。電泳完畢后，進(jìn)行銀染，通過(guò)成像儀拍照并保存。

圖1 海南島6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨種群基因組 DNA 電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of genomic DNA of 6 populations of Asplenium nidus in Hainan Island

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析將SRAP 記錄的電泳圖進(jìn)行人工讀帶，由圖1 可得，以同一位點(diǎn)有帶記作“1”，無(wú)帶記作“0”，僅記錄清晰、穩(wěn)定且長(zhǎng)度在300～2 500 bp 的擴(kuò)增條帶，形成0-1 矩陣二元數(shù)據(jù)輸入電腦。

采用POPGENE32 軟件衡量SRAP 水平上遺傳變異程度，對(duì)全部種群和各個(gè)種群分別進(jìn)行遺傳參數(shù)分析，分別對(duì)有效等位基因數(shù)(Ne, effective number of allele)、等位基因觀察值(Na，number of allele)、多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB，percentage of polymorphic bands)、Nei’s 基因多樣性(He，Nei’s genetic diversity)、Shannon 信息指數(shù)(Ho，Shannon’s information index)[16?17]、種群總基因多樣度(Ht，total gene diversity)、種群內(nèi)基因多樣度(Hs，gene diversity within populations)、種群間的基因流(N，geneflow)，種群間遺傳分化系數(shù)(Gst，coefficient of population differentiation)、Nei’s 無(wú)偏差遺傳距離(D，Nei’s genetic distance)和遺傳一致度(I，genetic identity)等參數(shù)進(jìn)行計(jì)算[18]。

應(yīng)用GenAlEx v.6(Genetic Analysis in Excel)軟件[19]對(duì)種群內(nèi)遺傳變異和種群間遺傳變異進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)，計(jì)算遺傳變異在種群內(nèi)和種群間分布。Shannon 信息指數(shù)HO由如下公式計(jì)算：

式中，HO為Shannon 信息指數(shù)，Pi為第i條帶的表型頻率。

遺傳分化系數(shù)（coefficient of genetic differentiation，Gst）用來(lái)估算種群間的遺傳分化程度，即種群間遺傳多樣性占總遺傳多樣性的比例。

式中，Gst為遺傳分化系數(shù)，Ht為種群的遺傳多樣度，Hs為各種群內(nèi)的基因多樣度，m為該位點(diǎn)上的等位基因，n為居群總數(shù)，rj為該位點(diǎn)上第j個(gè)等位基因在總種群中的平均頻率，qij為第i個(gè)種群在該位點(diǎn)上第j個(gè)等位基因頻率，mi為第i個(gè)種群在該位點(diǎn)上的等位基因數(shù)。

基因流（gene flow）用來(lái)估算種群間基因交流程度，為每個(gè)世代在種群間遷移的個(gè)體數(shù)，是通過(guò)遺傳分化系數(shù)來(lái)估算的：

式中，Nm為基因流，N為有效種群大小；m為種群每代遷移率；Gst為遺傳分化系數(shù)。

根據(jù) Nei’s 遺傳距離,使用NTSYS-pc 2.1 軟件對(duì)種群進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析，樣本數(shù)為85。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南島鳥(niǎo)巢蕨自然種群的遺傳多樣性利用17 個(gè)正向引物與20 個(gè)反向引物共340 對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出10 對(duì)條帶清晰、穩(wěn)定性高、特異性好且多態(tài)性豐富的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用于鳥(niǎo)巢蕨的遺傳多樣性分析[15]。其中，正向和反向引物序列見(jiàn)表2，10 對(duì)引物組合為：ME3-EM3、ME4-EM10、ME5-EM8、ME6-EM16、ME5-EM7、ME10-EM10、ME14-EM6、ME16-EM14、ME16-EM10、ME3-EM4。

引物用于對(duì)海南島鳥(niǎo)巢蕨6 個(gè)野生種群共96 個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，由擴(kuò)增結(jié)果（圖2）可看出，一共擴(kuò)增出184 個(gè)清晰穩(wěn)定的條帶，篩選6 條清晰條帶進(jìn)行分析，其中174 條具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)百分率為94.57%。從圖1 可看出，每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶為5～9 條，平均條帶數(shù)為6.9。條帶分子量在250～2 000 bp之間，而表3 里的各種群間多態(tài)位點(diǎn)百分率存在較大的差異。基于SRAP 分子標(biāo)記的鳥(niǎo)巢蕨物種水平多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPB)為94.57%，SRAP 檢測(cè)到的種群多態(tài)位點(diǎn)百分比例(PPB)在76.09%(LMS2 種群)～94.57%(LMS3 種群)之間，平均為85.15%，鳥(niǎo)巢蕨種群間遺傳變異程度較大(76.09%～94.57%)，說(shuō)明各種群均具有較高的遺傳多樣性水平。

表2 SRAP 分析中使用的正向和反向引物序列Tab.2 Forward and Reverse Primer sequences used in SRAP analysis

圖2 6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨鳥(niǎo)巢蕨種群的PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of six populations of Asplenium nidus

表3 鳥(niǎo)巢蕨6 個(gè)自然種群SRAP 標(biāo)記遺傳多樣性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.3 Genetic diversity (Mean±SE) of 6 natural populations of Asplenium nidus based on SRAP markers

2.2 鳥(niǎo)巢蕨的遺傳分化POPGENE 軟件分析結(jié)果表明，種群間和種群內(nèi)均存在一定遺傳變異，但主要發(fā)生在種群內(nèi)部。種群總基因多樣度(Ht)為0.346 2±0.018 3，其中，種群內(nèi)基因多樣度(Hs)為0.301 0±0.014 2，即86.94%的遺傳分化發(fā)生在種群內(nèi)部；種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.130 6，即種群間遺傳分化為13.06%，說(shuō)明鳥(niǎo)巢蕨種群間遺傳分化水平較高，且遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)部。種群間基因流Nm=1.664 2，表明鳥(niǎo)巢蕨之間基因流動(dòng)暢通。

AMOVA 分析表明，遺傳變異以居群內(nèi)變異為主，此分析結(jié)果與POPGENE 的分析結(jié)果基本一致，由表4 可看出，顯著的遺傳分化(P= 0.010)于種群內(nèi)部和種群間均存在，遺傳變異在種群間占總遺傳變異的10.62%，在種群內(nèi)占89.53%。

2.3 鳥(niǎo)巢蕨種群間的遺傳距離與相似系數(shù)從表5可知，鳥(niǎo)巢蕨6 個(gè)種群的平均遺傳相似度為0.922 4，平均遺傳距離為0.080 9。其中，BW 和EXL 的遺傳距離最近，為0.050 8，LMS2 和LMS3 遺傳距離最遠(yuǎn)，為 0.116 6。

表4 鳥(niǎo)巢蕨自然種群遺傳變異的AMOVA 分析Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA) of natural populations of Asplenium nidus

表5 基于SRAP 6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨種群間的遺傳相似度和遺傳距離Tab.5 Genetic similarity and genetic distance among the 6 populations of Asplenium nidus based on SRAP

SRAP 標(biāo)記對(duì)6 個(gè)種群鳥(niǎo)巢蕨野外種群遺傳距離的UPGMA 聚類(lèi)分析結(jié)果表明，海南島6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨種群可分為三大類(lèi)：由圖3 可得，地理位置較近的BW 和EXL 為第I 類(lèi)；同一地區(qū)的LMS1 和LMS3聚類(lèi)在了一起為第II 類(lèi)；而LMS2 與其余種群為第Ⅲ類(lèi)，其遺傳距離最大，遺傳分化也最顯著。

圖3 海南島鳥(niǎo)巢蕨6 個(gè)種群Nei’s 遺傳距離UPGMA 聚類(lèi)圖Fig.3 Dendrogram of the six natural populations of Asplenium nidus in Hainan Island based on Nei ’s makers using UPGMA cluster analysis

3 討 論

3.1 鳥(niǎo)巢蕨自然種群遺傳多樣性遺傳多樣性是生物多樣性重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)[16?17]，也是分析物種進(jìn)化潛力和未來(lái)命運(yùn)重要方向[18]。遺傳多樣性大小是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提[20]。遺傳多樣性越高的物種對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易在其分布范圍內(nèi)擴(kuò)展和開(kāi)拓新生境[20?21]。

本研究結(jié)果表明，海南島野生鳥(niǎo)巢蕨種群具有較高遺傳多樣性，多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPB)在76.09%(LMS2 種群)～94.57%(LMS3 種群)之間，平均為85.15%。該結(jié)果與潘麗芹等[22]的荷葉鐵線蕨自然居群的遺傳多樣性研究和董元火等[23]的水蕨的生境及其遺傳多樣性分析結(jié)果相似，但與黃慶陽(yáng)等[24]對(duì)香鱗毛蕨種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP 分析研究結(jié)果存在一定差異。原因可能是研究材料地理分布差異較大，或使用的分子標(biāo)記技術(shù)不同所導(dǎo)致。本研究中，野生鳥(niǎo)巢蕨種群間生境差異不大，但隨著海拔增加，氣候、土壤、植被等也隨之發(fā)生了明顯變化，因而造成6 個(gè)種群較高遺傳多樣性。其中，LMS3 地區(qū)遺傳多樣性最高（Ne、He、Ho分別為1.533 2、0.322 5、0.488 1），可能黎母山（LMS）作為海南三大江河（南渡江、萬(wàn)泉河、昌化江）的發(fā)源地，石灰?guī)r溝谷較多，符合鳥(niǎo)巢蕨對(duì)生境要求。加上黎母山林區(qū)屬熱帶季風(fēng)氣候，季風(fēng)帶來(lái)長(zhǎng)期潮濕更有利于鳥(niǎo)巢蕨孢子傳播和更新，而霸王嶺樣地鳥(niǎo)巢蕨種群遺傳多樣性最小（Ne、He、Ho分別為1.479 9、0.282 2、0.422 7）；有兩個(gè)方面的原因：一是所采集個(gè)體的海拔分布較低，受人為干擾較重；另一原因可能是鳥(niǎo)巢蕨分布地受季風(fēng)影響較小，不利于孢子傳播和附著。本研究結(jié)果表明，在海南島6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨種群中LMS3 鳥(niǎo)巢蕨種群內(nèi)部遺傳變異最多，而B(niǎo)WL 鳥(niǎo)巢蕨種群內(nèi)部遺傳變異則相對(duì)較少。

3.2 種群的遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)遺傳結(jié)構(gòu)指種群中遺傳變異分布的時(shí)空格局，其在基因流、基因突變和自然選擇的共同作用下形成，也與物種進(jìn)化史和生物學(xué)特性有關(guān)[25?26]。

鳥(niǎo)巢蕨雖然在種群和物種水平均具有較高的遺傳多樣性，但相比較而言，種群水平遺傳多樣性要低于物種水平，與種群間具有較高基因流（Nm=1.664 2，Nm>1）有關(guān)，使漂變成為劃分種群遺傳結(jié)構(gòu)主導(dǎo)因素，表明鳥(niǎo)巢蕨距離較遠(yuǎn)種群間也存在一定程度基因交流[27?28]。遺傳分化程度Gst為0.130 6，在0.05～0.15 之間，屬于中等程度遺傳分化。

基于SRAP 標(biāo)記得出6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨野生種群多態(tài)位點(diǎn)百分率、Shannon 信息指數(shù)(Ho)、Nei’s 基因多樣性(He)、種群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)和總遺傳多樣性指數(shù)，通過(guò)AMOVA 分析結(jié)果顯示總的種群間變異為11%，說(shuō)明鳥(niǎo)巢蕨種群內(nèi)存在豐富的遺傳變異，6 個(gè)鳥(niǎo)巢蕨野生分布種群間均有較高遺傳變異，黎母山種群與其他5 個(gè)種群遺傳變異最明顯。蔣速飛等[29]發(fā)現(xiàn)，豐富的遺傳變異可能是物種具有較高遺傳多樣性的原因之一 。由于鳥(niǎo)巢蕨是孢子繁殖，孢子不易于長(zhǎng)距離遷徙，易造成地理隔離，推測(cè)地理隔離可能是造成鳥(niǎo)巢蕨種群間遺傳分化較大原因，而較高遺傳變異可能是本研究中各鳥(niǎo)巢蕨種群間遺傳多樣性較高的原因之一[30]。

3.3 鳥(niǎo)巢蕨自然種群保護(hù)物種遺傳多樣性水平能反映其適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力，還有助于物種稀有或?yàn)l危原因及過(guò)程的探討[31]。對(duì)珍稀瀕危物種保護(hù)方針和措施的制定，如采樣策略遷地或就地保護(hù)選樣等都有賴(lài)于人們對(duì)物種遺傳多樣性認(rèn)識(shí)[32?33]。鳥(niǎo)巢蕨靠孢子繁殖，而孢子適宜在潮濕的環(huán)境生長(zhǎng)，海南島氣候十分適宜鳥(niǎo)巢蕨繁殖生長(zhǎng)，本研究也證實(shí)海南島鳥(niǎo)巢蕨具較高遺傳多樣性，說(shuō)明在本研究所選區(qū)域現(xiàn)階段人為活動(dòng)對(duì)鳥(niǎo)巢蕨的數(shù)量和遺傳多樣性影響較小，各區(qū)域還有一定數(shù)量鳥(niǎo)巢蕨種群分布。

值得注意的是，一旦生境遭到破壞會(huì)直接導(dǎo)致孢子不能傳播和存活，鳥(niǎo)巢蕨原生基因就會(huì)喪失，其遺傳多樣性也會(huì)隨之降低。建議鳥(niǎo)巢蕨保護(hù)應(yīng)以就地保護(hù)為主，可選擇鳥(niǎo)巢蕨種群遺傳多樣性較高的黎母山保護(hù)區(qū)區(qū)域（如本研究的黎母山LMS3 區(qū)域）建立級(jí)別更高的自然保護(hù)區(qū)，加大保護(hù)和自然恢復(fù)力度，擴(kuò)大保護(hù)邊界。針對(duì)鳥(niǎo)巢蕨孢子不易于長(zhǎng)距離遷徙導(dǎo)致不同種群之間遺傳分化較大這一現(xiàn)象，可對(duì)不同自然群體中鳥(niǎo)巢蕨個(gè)體遷地保護(hù)，結(jié)合采用重引入技術(shù)進(jìn)行自然居群恢復(fù)，提高種群競(jìng)爭(zhēng)力和多樣性，擴(kuò)大群體間基因交流，最大限度保障鳥(niǎo)巢蕨遺傳多樣性，促進(jìn)熱帶雨林國(guó)家公園建成。