香蕉灰紋病的病原鑒定及其生物學特性

扶艷萍，漆艷香，謝藝賢，彭 軍，曾凡云，張 欣

（1.華中農業大學 植物科學技術學院，武漢 430070; 2.中國熱帶農業科學院 環境與植物保護研究所/農業農村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海口 571101）

香蕉（Musaspp.）是我國南亞熱帶地區重要的經濟作物。香蕉灰紋病（又稱香蕉暗雙孢霉葉斑病）已成為我國香蕉產區常見且危害嚴重的病害之一，嚴重威脅著香蕉產業健康持續發展[1?6]。該病主要危害葉片，且常和Sigatoka 葉斑病混合發生，造成多種病原的復合侵染[7?9]。目前國外已報道的引起香蕉灰紋病的病原真菌有Neocordana musae（Cordana musae）、N.johnstonii（C.johnstonii）、N.musicola、N.musarum、N.musigena及N.malayensis等[10?15]，國內已報道的有C.musae[4,16?18]，但國內相關報道只是進行形態與培養性狀觀察，未進行分子生物學的進一步驗證。為了進一步明確海南香蕉灰紋病病原菌的種類及其生物學特性，本研究從海南香蕉主產區采集多份病葉進行組織分離純化和致病性測定，采用傳統形態學特征觀察、rDNA-ITS 測序及其系統發育樹分析等方法對該病害病原進行鑒定，并在此基礎上測定了該菌在不同培養基、溫度、pH、碳源、氮源、光照、通氣等條件下的生物學特性，以期為深入研究海南香蕉灰紋病的發生流行及防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與培養從海南香蕉產區采集典型灰紋病癥狀的香蕉葉片，用無菌水沖洗干凈并晾干，采用組織分離法[19]進行病原菌分離。在病健交界處取3～5 mm 的組織塊，先用0.1 %升汞消毒1 min，再用75 %乙醇漂洗30 s 后，用無菌水漂洗3 次，再用濾紙吸干水分，移至PDA 培養基上培養。待菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲塊，置于PDA 平板上進一步純化培養。分離純化后的菌種轉移到PDA 斜面培養基上保存備用。

1.2 致病性測定選用PDA 平板上培養7 d 的菌絲塊對健康香蕉植株葉片進行刺傷接種。挑選生長良好、生育期相近、植株大小比較一致的巴西蕉植株6 株，先用清水沖洗巴西蕉葉片，再用無菌水清洗巴西蕉葉片，后用75%酒精沖洗滅菌進行表面消毒，無菌水沖洗3 次，晾干后備用。每株選取1 片葉片，用滅菌針在葉脈左右相對位置進行刺傷，取直徑6 mm 菌絲塊接種于經滅菌針刺傷的葉片（菌絲面緊貼葉片傷口處），每片葉接種2 塊菌絲塊，以未接菌PDA 瓊脂塊為對照，每個處理3 次重復。用脫脂棉覆蓋菌絲塊，期間噴無菌水保濕48 h，3 d 后移去菌絲塊，觀察葉片發病情況。待接種葉片發病后，根據柯赫氏法則，從病斑處分離病原菌，并觀察與原接種病原菌形態特征是否一致。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態學鑒定將分離純化得到的病原菌轉接至PDA 平板上，于28 ℃培養箱中黑暗條件下培養7 d，期間觀察并記錄菌落顏色、形態、氣生菌絲疏密程度等形態特征。在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子和分生孢子梗形態。

1.3.2 分子生物學鑒定將供試菌株接種到PDA 培養基上，28 ℃培養7 d，用載玻片刮取培養基表面的菌絲備用。采用CTAB 法[20]提取菌株基因組DNA，用真菌核糖體基因內轉錄間隔區通用引物ITS1 與ITS4[21]對其rDNA-ITS 區進行PCR 擴增，PCR 產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。利用EMBL 數據庫中Clustal Omega 程序、GenBank 數據庫中的Blastn 程序和MEGA 6 軟件進行各序列間的同源性和進化距離的分析與比較，并構建NJ 系統進化樹。

1.4 病原菌生物學特性測定

1.4.1 培養基對菌絲生長的影響制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）、燕麥片瓊脂培養基（OA）、胡蘿卜瓊脂培養基（CA）、玉米粉瓊脂培養基（CMA）、查氏培養基（CDA）及香蕉葉片煎汁瓊脂培養基（LEDA）。將病原菌接種于PDA 培養基上，28 ℃培養7 d，用滅菌的6 mm 打孔器在菌落邊緣上打取菌絲塊，接種至各種培養基平板上。各處理重復5 皿，在28 ℃下培養，并采用十字交叉法每隔2 d 測量菌落直徑，按菌絲生長速率=菌落平均直徑（cm）/培養時間（d），計算菌絲在各供試培養基上3、5、7、9 d 的生長速率（cm·d?1）和滿皿時間（d）。

1.4.2 溫度對菌絲生長的影響將接有6 mm 病原菌菌絲塊的PDA 平板分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養，各處理重復5 皿，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.3 pH 對菌絲生長的影響用磷酸緩沖液（0.2 mol·L?1磷酸二氫鈉、0.2 mol·L?1磷酸氫二鈉）配制PDA 培養基，再用1 mol·L?1磷酸、1 mol·L?1NaOH 調節pH 值至4、5、6、7、8、9、10(7 個梯度)。將6 mm病原菌菌絲塊分別轉接不同pH 的PDA 平板上，28 ℃恒溫培養，各處理重復5 皿，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.4 碳源對菌絲生長的影響將6 mm 病原菌菌絲塊轉接至含有不同碳源的查氏培養基上。碳源分別是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉和果糖，以不加碳源為對照，各處理重復5 皿，28 ℃恒溫培養，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.5 氮源對菌絲生長的影響將6 mm 病原菌菌絲塊轉接至含有不同氮源的查氏培養基上。氮源分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、脲、磷酸氫二銨、硝酸鈉、氯化銨和硫酸銨，以不加氮源為對照，各處理重復5 皿，28 ℃恒溫培養，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.6 光照對菌絲生長的影響將接有6 mm 病原菌菌絲塊的PDA 平板分別置于24 h 全光照、24 h 全黑暗、12 h 光照12 h 黑暗、16 h 光照8 h 黑暗（長日照）、16 h 黑暗8 h 光照（短日照）5 種光照處理下，各處理重復5 皿，28 ℃恒溫培養，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.7 通氣條件對菌絲生長的影響將6 mm 病原菌菌絲塊置于盛有100 mL PD 液體培養基的250 mL三角瓶中，每瓶裝3 個菌絲塊，設3 種培養方式：28 ℃恒溫靜置、28 ℃恒溫搖床振蕩以及28 ℃恒溫振蕩12 h 靜置12 h，其中搖床振蕩轉速梯度分別設置為50、100、150、200 r·min?1，各處理重復3 瓶，7 d 后稱取菌絲的干、濕質量。

1.4.8 致死溫度病原菌在PDA 培養基上培養7 d 后，加入40 mL 無菌水，用滅菌三角棒刮取病原菌菌絲，制成菌懸液；分別取5 mL 至各滅菌試管中，分別置于室溫（27.2 ℃），40，45，50，55，60，65，70 ℃的水浴中，分別水浴5，10，15，20 min，共32 個處理，期間緩緩搖動試管，以保證溫度均勻。水浴后立即取出用冷水降溫，取0.5 mL 菌懸液涂于PDA 培養基上，各處理重復5 皿，28 ℃恒溫培養，7 d 后觀察生長情況。

1.5 數據分析與處理對數據進行單因素方差分析，并用Duncan 法比較均值間的差異顯著性，以上所有統計過程均用Excel 2019 和Spss 軟件26.0.0.0 完成。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離與致病性測定采用組織分離法從發病香蕉葉片分離獲得6 株純化的真菌菌株，菌落形態觀察及鏡檢表明，6 株分離菌形態特征一致，為同一種真菌。接種后第3 d，葉片刺傷處（6 個菌絲塊接種點）均開始發病，發病率為100%，而PDA 瓊脂塊接種的對照葉片均未發病。菌絲塊接種點病斑為短橢圓形，隨葉脈方向擴展，外圍具黃色暈圈，中間灰褐色，有輪紋，其發病癥狀（圖1A）與田間發病癥狀相似（圖1B）。根據柯赫氏法則，從接種發病的香蕉葉片上重新分離到與原接種菌株形態特征一致的真菌，確認6 株分離菌株為香蕉灰紋病的致病菌。

2.2 病原菌鑒定病原菌在PDA 培養基上的菌落正面呈圓形，灰白色，絨毛狀，邊緣不整齊，有輪紋；基底中菌絲灰褐色至灰黑色，質地緊密，生長旺盛（圖1C）；菌落背面呈黑褐色，同心輪紋狀，邊緣明顯，有淡黃色暈圈（圖1D）。經顯微鏡觀察發現，分生孢子梗褐色、直立、無分枝；分生孢子梗頂端突出膨大，產孢（圖1E）；分生孢子雙胞、倒卵形，隔膜處有縊縮，透明或微褐色，孢子頂端具臍點（圖1F）。根據病原菌的培養性狀與形態學特征，參考HERNáNDEZ-RESTREPO 等[12]、戚佩坤[16]及PLOETZ 等[22]的描述，將海南的香蕉灰紋病病原初步鑒定為暗雙孢屬真菌（Neocordanasp.）。

圖1 香蕉灰紋病癥狀及其病原菌形態特征A：香蕉灰紋病回接發病癥狀；B：香蕉灰紋病田間發病癥狀；C：菌落正面；D：菌落反面；E：分生孢子梗；F：分生孢子。Fig.1 Symptoms of Cordana leaf spot and its pathogen morphologyA: Symptoms of Cordana leaf spot on inoculated leaves; B: Symptoms of Cordana leaf spot on leaves in the field; C: Front of colony; D: Back of colony; E: Conidiophore; F: Conidia.

提取6 株病原菌的基因組DNA，利用rDNA-ITS 通用引物對ITS1/ITS4 進行PCR 擴增，PCR 產物經測序及序列多重比對，發現6 株病原菌的rDNA-ITS 區擴增片段長度均為575 bp，且相似性為100%。選擇1 號菌株的ITS 序列提交到GenBank（登錄號：MN960387），并命名為CATAS-CM01。經GenBank 數據庫Blantn 比對分析，CATAS-CM01 與GenBank 中公布的Neocordana musae（LN713276-LN713278，LN713280-LN713282，KP770138）相應片段最相近，相似性達99.28%～99.65%，與N.malayensis（MK442593）、N.musarum（KY173424-KY173425）、N.musigena（KY979749-KY979750）及N.musicola（LN713283-LN713285）相應片段序列相似性為95.6%～98.58%，而與其他屬菌株同源性較低，約87%的相似性。以Magnaporthe grisea（登錄號：MH864859、FN555111）、Pyricularia pennisetigena（登錄號：MN889450、MH412638）、Pyricularia angulata（登錄號：MT071757、JF719830）作為外群構建菌株CATAS-CM01 的rDNA-ITS 基因系統發育樹，結果顯示CATAS-CM01 與香蕉暗雙孢菌云南分離株XJ13-12-01（登錄號：KP770138）及6 株N.musae模式菌株CPC 19605、CPC 16362、CPC 17293、CPC 17237、CPC 16298 和CPC 18127（登錄號：N713276-LN713278，LN713280-LN713282）以81%的置信度聚在同一分支，遺傳距離最近（圖2）。結合6 株病原菌的形態學特征，最終將病原菌鑒定為香蕉暗雙孢菌Neocordanamusae（Cordana musae）[12]。

圖2 菌株CATAS-CM01 基于rDNA-ITS 序列構建的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of pathogenic fungus CATAS-CM01 based on rDNA-ITS sequences

2.3 病原菌生物學特性測定

2.3.1 培養基對菌絲生長的影響病原菌在7 種培養基上均能生長，其中生長最快的是LEDA 和CMA 培養基，平均生長速率分別為0.56 cm·d?1和0.55 cm·d?1，滿皿時間分別為18 d 和19 d，菌落邊緣規則，但氣生菌絲輕薄；其次是OA 培養基和PDA 培養基，平均生長速率均為0.49 cm·d?1，滿皿時間為21 d，菌落邊緣雖不規則，但氣生菌絲較緊密，PDA 培養基上的菌落有輪紋；生長較慢的培養基依次為PSA、CA 和CDA，平均生長速率分別為0.44、0.39、0.35 cm·d?1，滿皿時間分別為23、26、29 d（表1）。OA、PDA、LEDA 及CMA 培養基上的菌落平均生長速率無顯著差異（P<0.05），結合菌落形態及滿皿時間，最適合菌落生長的培養基為OA 和PDA。病原菌菌絲的生長速率隨天數的增加而逐漸減慢，在7 d 時各培養基上菌絲的生長速率逐漸趨于穩定（圖3）。

表1 不同培養基對暗雙孢菌菌絲生長的影響Tab.1 Effect of different culture mediums on mycelial growth of N.musae

圖3 暗雙孢菌菌絲在不同培養基上的生長速率Fig.3 Effect of different culture media on the growth rate of N.musae

2.3.2 溫度對菌絲生長的影響病原菌在10～40 ℃范圍內均能生長，適宜生長溫度為25～30 ℃，與其他處理溫度有顯著差異（P<0.05），且最適生長溫度為30 ℃。溫度≤15 ℃或者≥35 ℃時，病原菌生長受抑制（圖4）。

2.3.3 pH 對菌絲生長的影響病原菌在pH 4～10 范圍內均可生長，pH 5～7 時生長較好，pH 為6 時生長最佳，與pH 7 差異不顯著，但與其他pH 有顯著差異（P<0.05）。pH 大于8 時，菌絲擴展受抑制（圖5）。

2.3.4 碳源對菌絲生長的影響病原菌在不同碳源的培養基上均可生長，其中對乳糖利用效果最好，與其他碳源有顯著差異（P<0.05），其次是蔗糖和淀粉，果糖利用效果最差（圖6）。

圖4 不同溫度對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of different temperatures on mycelial growth ofN.musae

圖5 不同pH 對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different pHs on mycelial growth of N.musae

2.3.5 氮源對菌絲生長的影響病原菌在不同氮源的培養基上均能生長，其中對蛋白胨、酵母膏及硝酸鈉利用較好，與其他氮源有顯著差異（P<0.05），且以酵母膏最佳，其次是脲、磷酸氫二銨和牛肉膏，氯化鈉和硫酸銨的利用最差（圖7）。

圖6 不同碳源對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on mycelial growth of N.musae

2.3.6 光照對菌絲生長的影響病原菌在5 種光照條件下均能生長，其中24 h 全光照條件下菌落直徑最大，為4.06±0.14 a（a、b、c、d 表示差異顯著性，下同）；其次是16 h 光照8 h 黑暗（長日照）和12 h光照12 h 黑暗，菌落直徑分別為3.80±0.05 ab，3.39±0.03 c；在24 h 全黑暗條件下菌落直徑最小，為2.96±0.09 d；8 h 光照16 h 黑暗（短日照）條件下菌落直徑為3.53±0.08 bc。全黑暗與全光照及光暗交替培養有顯著差異，說明光照利于菌絲生長。

2.3.7 通氣條件對菌絲生長的影響通氣與不通氣對菌絲生長均有一定影響，在4 種轉速梯度中，均以24 h 振蕩培養的菌絲濕質量、干質量最大，與其他處理差異最顯著（P<0.05），其中以轉速200 r·min?1時，菌絲濕質量、干質量分別達4.50 g 和2.91 g；其次是12 h 振蕩12 h 靜置；24 h 靜置處理條件下，菌絲濕質量、干質量最低（表2）。

2.3.8 致死溫度測定病原菌菌絲在60 ℃下水浴10 min 后仍能在PDA 平板上正常生長，但在60 ℃及以上溫度處理15 min 后不能生長，說明病原菌菌絲的致死溫度為60 ℃ 10 min（表3）。

圖7 不同氮源對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of N.musae

表2 通氣條件對暗雙胞菌菌絲生長的影響Tab.2 Effect of ventilation condition on mycelial growth of N.musae

表3 暗雙胞菌菌絲的生長致死溫度Tab.3 The lethal temperature on mycelial growth of N.musae

3 討 論

香蕉灰紋病是香蕉生長過程中重要的葉部病害之一，病害流行時可導致香蕉減產30%～50%[5]，引起香蕉灰紋病的病原有6 種[10?15]。Hernández-Restrepo 等[12]依據形態學特征和LSU 及ITS 序列分析等相關數據，提出將香蕉灰紋病病原C.musae[10]、C.johnstonii[11]、C.musicola及其相關種從Cordana屬中分出來，歸入新屬Neocordana。此命名代表了該菌的最新分類進展，已得到部分研究者的承認[13?15]，但目前也有部分國內外研究者仍用Cordana屬描述香蕉灰紋病病原菌[6,23?24]。

傳統真菌病害的鑒定主要是根據病害癥狀特征、病原真菌的形態學及生物學等特性進行，但有些植物病原真菌在不同培養條件下形態變異較大，給真菌的分類鑒定帶來了一定的難度。真菌DNA 的堿基組成遺傳穩定，不易受環境影響，而且在其生活史的任何階段均可獲得，其中rDNA 的ITS 區段既具保守性，又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS 區序列進行PCR 擴增、測序以及序列分析是鑒定真菌的常用方法。RENSKE 等[25]認為，通過比對真菌ITS 區，序列相似性大于99%時，可鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%時，可鑒別為相同屬；序列相似性小于95%時，可鑒別為相同科。本研究對分離菌株的ITS 序列進行比對分析并構建了系統發育樹，依據Renske 等[25]研究結論結合分離菌株的培養性狀、形態學特征及其柯赫氏法則驗證，將海南香蕉灰紋病的病原鑒定為香蕉暗雙孢菌Neocordana musae。

為了便于病害的預測預報及科學防治，筆者進一步研究了該病原菌的生物學特性，確認該病原菌最適培養基為PDA 培養基和OA 培養基，最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH 為6，可利用多種碳源、氮源，光照、通氣利于菌絲生長，致死條件為60 ℃ 10 min。這與該病原菌適應環境能力較強的研究結論基本一致[18,23]。

另外，本實驗供試菌株在40 ℃也能正常生長，致死條件為60 ℃ 10 min，與番華彩等[18]對在云南分離的香蕉暗雙孢菌生物學特性的研究結果存在差異；進一步的系統進化樹分析也發現，代表菌株CATAS-CM01 與來自墨西哥培養型模式菌株（CPC 16362、CPC 16298）、澳大利亞培養型模式菌株（CPC 17237、CPC 17293）遺傳距離較近，處于同一小分支，而與國內云南分離株（XJ13-12-01）遺傳距離較遠。以上研究表明，香蕉灰紋病菌的生物學特性隨地域的不同有一定差異，這可能是該病原菌在不同區域具有不同的生態適應性，具體原因還有待進一步研究。本研究僅探討了培養基、溫度、pH、碳氮源、光照及通氣等因素對香蕉暗雙孢菌菌絲生長的影響，因此結果具有一定的局限性。下一步，本實驗室將開展病原菌孢子產生與萌發條件及病原菌致病性分化與遺傳變異等方面的觀測與研究，探討香蕉灰紋病菌群體遺傳特征，以期為海南香蕉灰紋病的監測預報和綜合防治提供更多理論依據。