效應蛋白OhEF 2 正調控擬南芥對橡膠樹白粉菌的感病性

程 度，戎 偉，梅雙雙

（1.海南大學 生命科學與藥學院，海口 570228; 2.海南大學 植物保護學院，海口 570228）

白粉菌（Powdery mildew）是一種專性活體寄生真菌，可以侵染多種植物，造成巨大的經濟損失[1?2]。白粉菌與寄主相互作用的過程中，首先刺入寄主細胞壁形成吸器（haustorium），從寄主細胞內獲取水分和營養物質。同時，白粉菌通過在吸器轉錄，翻譯形成大量的效應蛋白（Effector proteins），分泌到寄主細胞內，從而實現在寄主體內的增殖和侵染[3?4]。目前，利用基因組、轉錄組測序及蛋白質組分析，通過對大麥白粉菌（Bgh，Blumeria graminisf.sp.Hordei）、小麥白粉菌（Bgt，Blumeria graminisf.sp.tritici）、擬南芥白粉菌（Gor，Golovinomyces orontii）、葡萄白粉菌（En，Erysiphe necator）和葫蘆白粉菌（Pxa，Podosphaera xanthii）等進行預測，發現了一些潛在的效應蛋白[5]。大麥和小麥白粉菌編碼的效應蛋白數量最多，通常是一些小的蛋白質，并且與已知蛋白同源性很低[6]。另外，大麥白粉菌形成的效應蛋白N 端通常含有一個保守的結構域：第一個氨基酸是芳香族氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸或色氨酸），最后一個氨基酸是半胱氨酸（Y/F/WXC）[7]。然而，雙子葉植物白粉菌編碼的效應蛋白并不是都含有該保守結構域[8?9]。白粉菌是專性活體寄生，無法進行遺傳操作，因此，目前對白粉菌效應蛋白功能的了解還非常少。最近，通過寄主誘導的基因沉默技術（HIGS，host-induced gene silencing），發現大麥白粉菌的一些效應蛋白在刺入寄主植物和形成吸器的過程中發揮毒性功能[10]。橡膠樹白粉病是由橡膠樹白粉菌（Oidium heveae)引發的一種真菌病害，對天然橡膠的生產造成了嚴重的經濟損失。該病于1918 年在印尼爪哇首次發現[11?13]，迄今已遍布全球各橡膠種植區。由于橡膠樹白粉菌與橡膠樹很難進行遺傳操作，因此嚴重阻礙了二者相互作用機理的研究。最近研究發現，橡膠樹白粉菌在野生型擬南芥Col-0 激發依賴于EDS1（enhanced disease susceptibility 1)和PAD4（Phytoalexin Deficient 4)的抗病反應，推測擬南芥TIR-NB-LRR（Toll-Interleukin1 Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)類抗性基因參與了對橡膠樹白粉菌的識別過程[14]。

通過基因組和轉錄組測序分析，預測出橡膠樹白粉菌含有133 個潛在的效應蛋白[8]，然而，這些效應蛋白的功能還是未知的。筆者克隆了橡膠樹白粉菌潛在的效應蛋白基因OhEF 2(Oidium heveaeeffector protein 2)，并對該效應蛋白結構進行分析，構建在Col-0 背景下的OhEF 2基因過表達轉基因植株。結果表明，過表達植株對橡膠樹白粉菌敏感性增加，并且有效降低了橡膠樹白粉菌在擬南芥上誘導的胼胝體沉積和致病相關基因的表達。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株植物材料：擬南芥野生型Col-0，Hevea brasiliensis73397；菌株：O.HeveaeHN1106[14]，假單胞菌DC 3000。

1.2 效應蛋白OhEF 2 擬南芥轉基因植株的構建橡膠樹葉片古銅期接種白粉菌，8 d 后剪取葉片，利用快速通用植物RNA 提取試劑盒3.0（北京華越洋公司，產品編號：0416-50）提取總RNA。反轉錄試劑盒（北京華越洋公司，產品編號：HYY871）進行反轉錄，獲得cDNA。設計用于擴增OhEF 2基因的引物OhEF 2-F 和OhEF 2-R，進行PCR 擴增。引物序列：OhEF 2-F，5′-AAACTCGAGCATCCTGGTCAGAAAC GAGA-3′；OhEF 2-R，5′-AAATTCGAAGTTTCCAATAGTTTGAGCAAT-3′（Gene_id:OH_02339）[8]。利用限制性內切酶Xho I和BstB I（NEB 公司）分別對PCR 擴增片段和pER8[15]載體進行酶切。T4（NEB 公司）連接酶進行連接，測序正確后轉入農桿菌GV3101。利用花粉管侵染方法，侵染擬南芥野生型Col-0。收取擬南芥種子，在含有潮霉素的MS 培養基中篩選，挑取長根的擬南芥植株，移栽土中。

1.3 植物葉片蛋白提取和蛋白質免疫印跡生長4 周后，噴灑雌激素，剪取1 個葉片，放入1.5 mL 離心管中，加入100 μL 蛋白提取液（0.15 mol·L?1KCl，50 mmol·L?1HEPES-KOH，pH 7.5，1 mmol·L?1EDTA，1 mmol·L?1DTT，0.2% Triton-X 100，cocktail 蛋白酶抑制劑），研碎后，12 000 r·min?1，4 ℃，離心10 min，取上清，加入loading buffer，進行SDA-PAGE 電泳[15]。

利用濕轉法在轉膜電泳槽（伯樂）中，將蛋白條帶轉移至PVDF 膜上，轉膜液(7.58 g Tris，36 g Glycine，800 mL 甲醇，加水至4 L),電壓100 伏，電泳1 h。5%的脫脂奶粉，室溫封閉2 h，加入FLAG 抗體（sigma），室溫孵育2 h，加入HRP 標記的羊抗鼠2 抗，室溫作用0.5 h，在黑暗條件下顯影、定影。

1.4 白粉菌細胞進入率計算方法將長40 cm，寬40 cm，孔徑為50 μm 的尼龍膜接種箱置于生長5 周的擬南芥植株上方，用毛筆刷將橡膠樹白粉菌從橡膠樹葉片刷到接種箱上，白粉菌透過接種箱，均勻灑落在擬南芥葉片上。橡膠樹白粉菌為橡膠樹古銅期葉片接種10 d 后的白粉菌孢子。接種1 d 后，剪取葉片，置于脫色液：體積比(乙醇︰苯酚︰水︰乳酸= 2︰1︰1︰1)中，脫色過夜。次日，于考馬斯亮藍染色液（G250，濃度為6 g·L?1乙醇溶液)中染色30 s。脫色后，顯微鏡下進行觀察。計數橡膠樹白粉菌產生1 根芽管和2 根芽管的白粉菌孢子數目。利用計算公式：2 根芽管孢子數目/(1 根芽管孢子數目+2 根芽管孢子數目)，計算細胞進入率[14]。

1.5 菌絲生長長度分析利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種2 d 后，剪取葉片，于脫色液中脫色過夜。考馬斯亮藍染色30 s，顯微鏡觀察，利用MIE3.1 軟件測量菌絲長度[14]。

1.6 葉片發病表型觀察及分生孢子計數利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種10 d 后，觀察葉片發病癥狀并進行拍照。剪取葉片置于脫色液中脫色過夜，考馬斯亮藍染色液中染色30 s，計數單個孢子產生的分生孢子數[14]。

1.7 擬南芥總RNA 提取和致病相關基因PR1 (Pathogenesis-Related Gene1)表達檢測利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種6 d 后。剪取葉片，置于遇冷的研缽中，加入液氮，研磨3 次。最后加入1 mL Invitrogen Trizol (Lot No.66223)，提取總RNA。經DNA 酶消化后，加水溶解。利用Invitrogen RNA 反轉錄試劑盒Ⅲ (Lot No.696045)對總RNA 進行反轉錄。熒光定量PCR 檢測采用SYBR Premix ExTaq Ⅱ(Lot No.AK2702)試劑，7500 ABI Real-time PCR Detection System，20 μL 反應體系。檢測程序為：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s、退火延伸62 ℃ 40 s，40 個循環。內參基因ACTIN 引物序列為：5′-TGGTGGAAGCACAGAAGTTG-3′；5′-GATCCATGTTTGGCTCCTTC-3′；PR1：5′-TACGCAGAACAAC TAAGAGG-3′；5′-TCGTTCACATAATTCCCACG-3′[14]。

1.8 胼胝體計數分析利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種6 d 后。將葉片置于脫色液，V水︰V甘油︰V乳酸︰V水飽和酚︰V乙醇=1︰1︰1︰1︰8，抽真空30 min，65 ℃放置60 min，10 min 搖1 次。50%酒精和水漂洗各漂洗1 次。將葉片置于染色液(0.1 g·L?1苯胺藍，150 mmol·L?1K2HPO4，pH9.5)中染色60 min。于熒光顯微鏡紫外激發光下照相。采用Image J 軟件(http://www.uhnresearch.ca/wcif)對0.1 mm2葉片面積內的胼胝體進行計數，每個樣品共計數6 片葉片，通過Student’s t test 進行統計分析,差異極顯著P<0.01,差異顯著P<0.05[14]。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹白粉菌效應蛋白OhEF 2 擬南芥轉基因植株的構建白粉菌通過分泌效應蛋白到植物體內，從而完成白粉菌的侵染過程。筆者克隆了其中的1 個效應蛋白基因OhEF 2（Gene_id:OH_02339）[8]，該蛋白編碼543 個氨基酸，信號肽分析發現1～21 個氨基酸為其信號肽序列（圖1）。為了研究該效應蛋白在植物體內的作用機理，設計引物，去除信號肽序列，經過PCR 擴增、酶切后連入雌激素誘導的轉基因載體pER8。利用潮霉素篩選，通過雌激素誘導和蛋白質印跡分析后，獲得了3 個在擬南芥Col-0 背景下獨立的OhEF 2轉基因植株，分別命名為OhEF 2-1，OhEF 2-2 和OhEF 2-3（圖2A，B）。雌激素誘導6 d 后，與野生型植物Col-0 和空載體轉基因植株對比，并未發現效應蛋白OhEF 2 可以激發擬南芥細胞壞死和發黃的表型（圖2B）。

圖1 效應蛋白OhEF 2 信號肽序列分析Fig.1 Signal peptide analysis of effector protein OhEF 2

圖2 橡膠樹白粉菌效應蛋白OhEF 2 擬南芥轉基因植株的構建A.效應蛋白OhEF 2 轉基因植株表型觀察；B.效應蛋白OhEF 2 轉基因植株蛋白表達分析。Bar=1 cm。Fig.2 The construction of Oidium heveae effector OhEF 2 transgenic plants in Arabidopsis Col-0 backgroundA.The phenotype observation of effector OhEF-2 transgenic plants; B.Protein detection of effector OhEF-2 transgenic plants.Bar=1 cm.

圖3 效應蛋白OhEF 2 正調控擬南芥對橡膠樹白粉菌的感病性A.橡膠樹白粉菌細胞進入率測定結果；B.橡膠樹白粉菌菌絲生長測定結果；C.分生孢子計數結果。**：P<0.01。Fig.3 Effector protein OhEF 2 positively regulates the susceptibility of Arabidopsis to Oidium heveaeA.Quantitative assessment of host cell entry rates; B.Quantitative analysis of hyphal growth of O.heveae; C.The numbers of conidiospores per colony were counted at 10 dpi.**: P<0.01.

2.2 效應蛋白OhEF 2 正調控擬南芥對橡膠樹白粉菌的感病性為了進一步研究效應蛋白OhEF 2 在植物體內的作用機理，在野生型Col-0，空載體轉基因植株和OhEF 2轉基因植株OhEF 2-1，OhEF 2-2 和OhEF 2-3 上分別接種橡膠樹白粉菌O.HeveaeHN1106。接種1 d 后，白粉菌細胞進入率統計分析結果表明，3 個轉基因植株顯著高于野生型Col-0 和空載體轉基因植株(圖3A)，Col-0 和空載體轉基因植株白粉菌細胞進入率約為35%,無明顯差異，3 個OhEF 2轉基因植株白粉菌細胞進入率約為75%，與野生型植物相比，差異極顯著(P<0.01)。接種2 d 后的菌絲生長長度計算結果表明，3 個OhEF 2轉基因植株同樣顯著高于野生型Col-0 和空載體轉基因植株(圖3B)，Col-0 和空載體轉基因植株菌絲長度約為30 μm，無明顯差異，3 個OhEF 2轉基因植株菌絲長度約為90 μm，與野生型植物相比，差異極顯著(P<0.01)。接種10 d 后，3 個OhEF 2轉基因植株出現典型的白粉病病斑（圖4A），野生型Col-0 和空載體轉基因植株并未出現白粉病病斑（圖4A），而是表現出葉片發黃的癥狀（圖4A）。分生孢子計數分析結果表明，橡膠樹白粉菌不能在野生型Col-0 和空載體轉基因植株上產生分生孢子，而在3 個OhEF 2轉基因植株上形成了大量的分生孢子（圖3C，4B）。綜上所述，效應蛋白OhEF 2 可以明顯增強擬南芥對橡膠樹白粉菌感病的表型。

2.3 效應蛋白OhEF 2 不能促進假單胞菌DC 3000 在擬南芥上的毒性效應蛋白OhEF 2 可以明顯提高橡膠樹白粉菌在擬南芥上的毒性，為了驗證OhEF 2 是否也可以促進其他病原菌的毒性，筆者在野生型擬南芥Col-0、空載體轉基因植株和OhEF 2轉基因植株OhEF 2-1，OhEF 2-2，OhEF 2-3 上接種了假單胞菌DC 3000。假單胞菌作為活體寄生病原微生物，其與寄主植物的互作機制已有比較深入的了解。分別在接種后0 d 和3 d 取樣、研磨、涂板，進行細菌計數。結果表明，假單胞菌DC 3000 在野生型植物和空載體轉基因植株以及OhEF 2轉基因植株上并未表現出明顯的生長差異（圖5），結果表明，效應蛋白OhEF 2 不能促進假單胞菌DC 3000 的毒性。

圖4 OhEF 2 轉基因植株葉片發病癥狀及顯微觀察結果A.葉片癥狀觀察結果，Bar=5 mm；B.顯微觀察結果，Bar=200 μm。Fig.4 Symptoms and light microscopy of leaves of OhEF2 transgenic plants inoculated with Oidium heveaeA.Symptoms of WT Col-0/ Empty vector and OhEF 2 transgenic plants at 10 dpi, Bar=5 mm; B.Light microscopy images,Bar=200 μm.

2.4 蛋白OhEF 2 抑制橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發的胼胝體沉積和PR1 基因表達效應蛋白OhEF 2 顯著增強了擬南芥對橡膠樹白粉菌的感病性，推測OhEF 2 可能抑制了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應。為了確定這一可能性，筆者在野生型Col-0、空載體轉基因植株和OhEF 2轉基因植株OhEF 2-1、OhEF 2-2、OhEF 2-3 上分別接種橡膠樹白粉菌O.HeveaeHN1106。接種6 d 后，剪取接種葉片，進行了胼胝體沉積分析和PR1基因表達分析。結果表明，與野生型相比，橡膠樹白粉菌在3 個轉基因植株上誘導的胼胝體沉積(圖6A，B)和PR1基因表達(圖7)都顯著降低，表明效應蛋白OhEF 2 有效地抑制了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發的抗病反應。

圖5 假單胞菌DC 3000 細菌生長結果Fig.5 Bacterial growth of Pseudomonas syringae DC 3000

圖6 效應蛋白OhEF 2 抑制橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發的胼胝體沉積A.胼胝體計數結果；B.葉片顯微觀察結果。**：P<0.01。Fig.6 Effector protein OhEF 2 inhibits the callose deposition triggered by Oidium heveae in ArabidopsisA.Average number of callose deposits per microscope field of 0.1 mm2 on Col-0 and OhEF 2 transgenic plants; B.Light microscopy images.Bar=200 μm.**: P<0.01.

3 討 論

與擬南芥的相互作用過程中，橡膠樹白粉菌對擬南芥野生型Col-0 激發抗病反應，并且這種抗病反應依賴于EDS1 和PAD4，但并不依賴于NDR1，推測擬南芥TIR-NB-LRR 類抗性蛋白可以識別橡膠樹白粉菌的效應蛋白，從而激活了下游的抗病信號通路[14]。筆者在前人研究的基礎上，克隆了橡膠樹白粉菌的1 個潛在效應蛋白基因OhEF 2，并構建了該基因在野生型Col-0 背景下雌激素誘導的過表達轉基因植株。通過雌激素誘導后，與野生型Col-0 和空載體轉基因植株相比，OhEF 2過表達轉基因植物并未出現明顯的植物葉片發黃表型，暗示著效應蛋白OhEF 2 在植物體內并不是發揮無毒蛋白的功能。

白粉菌作為專性活體寄生真菌，通過分泌大量的效應蛋白到寄主細胞內，發揮毒性功能，幫助白粉菌在寄主體內的侵染和繁殖[16?17]。大麥白粉菌效應蛋白CSEP0064 可以與植物細胞內PR10 蛋白發生相互作用，干擾宿主細胞內核糖體RNA 的降解，抑制植物的免疫反應[18]。通過寄主誘導的基因沉默技術，發現白粉菌Podosphaera xanthii效應蛋白PEC 可以抑制植物細胞內活性氧的產生[10]，從而促進白粉菌的繁殖。筆者通過在野生型Col-0過表達效應蛋白OhEF 2，發現效應蛋白OhEF 2 顯著增強了橡膠樹白粉菌的毒性功能，并有效降低了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發的胼胝體沉積和PR1基因表達。胼胝體沉積在白粉菌的侵染過程中發揮非常重要的作用，在白粉菌侵染早期形成的刺入釘位置，植物細胞產生大量的胼胝體，從而抑制白粉菌的侵染。胼胝體合成酶基因PMR4突變后，植物對白粉菌的感病性大大增強[19]，表明效應蛋白OhEF 2 可能參與了白粉菌侵染的早期階段，與胼胝體形成的相關基因發生相互作用，從而抑制了胼胝體沉積。另外，PR1基因作為效應蛋白激發免疫信號通路ETI（Effector triggered immunity）的標志基因[20]，暗示著效應蛋白OhEF 2 抑制了植物抗性蛋白識別橡膠樹白粉菌后激發的免疫反應。然而，OhEF 2 并不能促進活體寄生假單胞菌DC 3 000 在擬南芥上的毒性，表明橡膠樹白粉菌與假單胞菌在植物體內的毒性作用機理可能是不相同的。OhEF 2 能否促進其他白粉菌的毒性功能，尚需進一步驗證。

圖7 效應蛋白OhEF 2 抑制橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發的PR1 基因表達**：P<0.01。Fig.7 Effector protein OhEF 2 inhibits the PR1 gene expression triggered by Oidium heveae in Arabidopsis**: P<0.01.