孤兒核受體Nur77的多功能性及其相關藥物靶點作用機制的研究進展

周 波，陳航姿，吳 喬

(廈門大學生命科學學院，細胞應激生物學國家重點實驗室，福建 廈門 361102)

核受體是一類依賴于配體的轉錄調節因子，在細胞生長與分化，凋亡、自噬、焦亡等細胞死亡，機體代謝與發育以及穩態維持等方面發揮重要的功能.核受體功能的紊亂將導致一系列疾病的發生，如癌癥、糖尿病、肥胖、不育、骨質疏松、阿爾茨海默病及心血管疾病等.核受體家族成員眾多，包括類固醇激素受體、維甲酸受體、甲狀腺激素受體、維生素D3受體及孤兒核受體[1-3].其中，孤兒核受體指無配體存在或暫時尚未發現其內源性配體的一類核受體.

核受體在機體的各器官組織中表達，與天然配體、激動劑或拮抗劑特異性結合后，可以發揮轉錄激活或轉錄抑制作用，因此，核受體被認為是一大類潛在的藥物靶點[4].許多核受體的配體及能夠激活核受體的藥物被廣泛應用于臨床疾病治療.例如：視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)的配體全反式維甲酸，與As2O3聯合使用對急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)具有良好的治療效果[5-6]；雌激素受體(estrogen receptor,ER)的拮抗劑雷洛昔芬(raloxifene)和他莫昔芬(tamoxifen)被廣泛用于乳腺癌的治療[7-9]；噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones,TZD)作為過氧化物酶體增殖激活型受體(peroxisome proliferators activated receptors, PPARs)的配體，被應用于Ⅱ型糖尿病的治療[10].因此，研究核受體相關的信號通路,尋找和開發以核受體為靶點的藥物已成為當下熱點和前沿.

核受體Nur77(也稱TR3、NGFI-B 和NAK1) 是由立早基因NR4A1編碼的蛋白，屬于類固醇/甲狀腺/維甲酸受體超家族的成員，結構上具有核受體的典型特征，但是其特異的內源性配體至今尚未被發現，因此被歸類為孤兒核受體[11].NR4A家族包含Nur77(NR4A1)、Nurr1(NR4A2) 和Nor-1(NR4A3) 3個成員[12].Nur77在細胞增殖、分化、凋亡、機體代謝、免疫和發育等過程中發揮重要的作用.鑒于Nur77在不同生物學過程中可發揮關鍵的調控作用，篩選以Nur77為靶點的體外激動劑和拮抗劑顯得尤為重要.

1 Nur77的分子結構特點

Nur77具有類固醇/甲狀腺/維甲酸受體超家族的典型結構特征，由氨基端的轉錄激活域(transcription-activating domain,TAD)、中部的DNA 結合域(DNA-binding domain,DBD)以及羧基端的配體結合域(ligand-binding domain,LBD)組成(圖1).其中，TAD是Nur77發揮轉錄激活作用的區域[13].DBD負責特異性識別單體Nur77 的應答元件(NGFI-B response element,NBRE)或者同源/異源二聚體形式的Nur77應答元件(Nur77 response element,NurRE)，從而調控下游基因的轉錄；且DBD包含兩個核定位信號(nuclear localization signal,NLS)序列，能夠影響Nur77的亞細胞定位[14-15].雖然目前并未發現Nur77的內源性配體，但是其結構上仍具備LBD，且LBD還具有調控Nur77轉錄激活活性、二聚化形成和亞細胞定位的功能[14,16].

圖1 Nur77結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of Nur77 structure

2 Nur77的調控方式

Nur77在不同的生物學過程中扮演著重要角色，其不僅作為轉錄因子調控下游靶基因的轉錄表達，還能作為調節因子通過蛋白間的相互作用調控其他蛋白的生物學功能.

2.1 基因轉錄調控

作為轉錄因子，Nur77主要通過其DBD與DNA應答元件結合，從而正調控或者負調控下游靶基因的轉錄和表達.Nur77不僅能以單體的形式與其應答元件NBRE結合[17](序列為AAAGGTCA)，而且還能夠以同源二聚體或者與其他家族成員(如Nurr1和Nor-1)形成異源二聚體的方式與應答元件結合[18-19](序列為TGATATTTACCTCCAAATGCCA).此外，在維甲酸受體的配體9-順式視黃酸作用下，Nur77 還可以與視黃素X受體(retinoid X receptor,RXR)形成異源二聚體，與RXR的應答元件DR-5結合發揮轉錄激活的作用[20].Nur77對長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的轉錄也具有調控作用，如本課題組發現在肝癌細胞中，Nur77可以轉錄激活lncRNA WFDC21P，從而抑制肝癌的發生發展[21].

Nur77對下游靶基因的調控不僅由Nur77蛋白水平的高低所決定，也與Nur77結合應答元件的強弱及其募集輔因子的能力有關.例如：在表皮生長因子刺激下，Nur77蛋白水平被顯著提高[22]，從而激活下游靶基因的轉錄，包括調控細胞周期的基因CyclinD、E2F1等[23-24]；凋亡誘導劑TPA的處理也能誘導Nur77蛋白水平的提高，激活Nur77下游凋亡相關基因的轉錄和表達[15,25-27].Nur77的翻譯后修飾也會影響其轉錄激活活性.例如：在T淋巴細胞以及鼠成纖維細胞中，蛋白激酶B1(Akt1)通過磷酸化Nur77 DBD上的第351位絲氨酸，削弱Nur77與應答元件結合的能力，從而抑制其轉錄激活活性[28-29]；而在腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)刺激下，位于Nur77 DBD上的第354位絲氨酸發生去磷酸化，進而促進Nur77與DNA結合，增強Nur77激活下游靶基因轉錄的能力[30].另外，Nur77的N端轉錄激活活性區域1(AF-1)可以通過募集輔激活因子如p300、SRCs、DIRP-205和PCAF等提高其轉錄激活活性[13].Nur77對輔抑制因子的募集則抑制其下游基因的轉錄.例如：在乳腺癌細胞中，Nur77能夠募集輔抑制因子SWI/SNF復合體及HDAC1結合到脂肪酸受體基因(CD36)和脂肪酸結合蛋白4基因(FABP4)的啟動子上，抑制兩者的表達，進而抑制脂肪酸吸收[31]；在腸癌細胞中，Nur77能夠募集輔抑制因子HDAC3和TLE1，與轉錄因子TCF4相互作用，從而抑制下游靶基因c-Myc的表達，進而抑制腸癌細胞的增殖[32].

2.2 蛋白相互作用調控

Nur77除了作為轉錄因子調控下游靶基因的轉錄與表達，很多研究還表明Nur77可以通過與一些蛋白的相互作用而影響其生物學功能.首先，Nur77可以通過與轉錄因子結合影響它們的轉錄激活活性.例如：Nur77和糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)結合可以互相抑制對方的轉錄激活活性；在視黃酸刺激下，Nur77通過與孤兒核受體雞卵清蛋白上游啟動子-轉錄因子(COUP-TF)競爭性結合到RXR上，可抑制COUP-TF與視黃酸響應元件(RARE)的結合，從而抑制下游靶基因的表達，進而抑制視黃酸誘導的細胞凋亡[33].本課題組也發現Nur77通過與β-連環蛋白(β-Cat)和T細胞因子4(TCF4)的相互作用抑制它們的轉錄激活活性，從而削弱Wnt信號通路的活性[32].Sun等[34]也發現Nur77與β-Cat的相互作用可以促進β-Cat降解，進而抑制β-Cat的活性.另外，Nur77通過與希佩爾-林道病腫瘤抑制蛋白(pVHL)的相互作用間接地抑制pVHL介導的缺氧誘導因子1α(HIF1α)泛素化降解，從而穩定HIF1α蛋白，促進血管內皮生長因子(VEGF)的表達和血管新生[35].

Chk2.細胞周期檢測點激酶2；JNK1.c-Jun氨基末端激酶1；p38α.有絲分裂原活化蛋白激酶p38α；GSK3β.糖原合成酶激酶3β； CK2.酪蛋白激酶2；ERK.細胞外調節蛋白激酶；PKA.蛋白激酶A；RSK.核糖體S6蛋白激酶；MSK.有絲分裂原和 應激激活的蛋白激酶.紅色為本課題組發現的磷酸化Nur77的位點，綠色為其他課題組發現的磷酸化Nur77的位點.圖2 各種蛋白激酶磷酸化Nur77的不同位點Fig.2 Different sites of Nur77 phosphorylation induced by various kinases

其次，Nur77可以與細胞中蛋白激酶、乙?；D移酶、甲基化轉移酶以及代謝酶等多種酶相互作用進而調控酶活性.例如，Nur77的C端LBD能夠介導Nur77與蛋白激酶Cθ(PKCθ)的結合，從而抑制PKCθ 的激酶活性，導致PKCθ介導的活化蛋白-1(AP-1)和核因子-κB(NF-κB)激活被抑制[36].本課題組的前期研究發現，p300的轉錄接頭區域能夠結合到Nur77 LBD上的FLELFIL序列；而Nur77的結合則覆蓋p300的組蛋白乙?；D移酶結構域，從而抑制p300的乙?；D移酶活性，導致下游靶基因的轉錄被抑制[37].Nur77和甲基化轉移酶PRMT1催化活性區域的相互作用可以抑制PRMT1對底物的甲基化[38].當肝癌細胞受到電離輻射時，Nur77可與DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)結合并被DNA-PK磷酸化，磷酸化的Nur77能提高p53磷酸化水平并增強其轉錄活性，促進電離輻射誘導的肝癌細胞凋亡[39].本課題組的研究還發現在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的心肌肥大過程中，Nur77的蛋白表達水平顯著提高，并且在小鼠中敲除Nur77可以顯著地削弱AngⅡ誘導的心肌肥大；進一步機制研究表明，Nur77能夠通過與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mTORC1)中的結節性硬化癥蛋白(TSC1/2)結合形成三聚體，促進TSC2發生泛素化修飾，進而通過蛋白酶體降解，導致mTORC1激活；mTORC1的激活引起蛋白合成增加，細胞內活性氧(ROS)水平提高以及細胞體積增大，最終導致心肌肥大[40].另外，本課題組也發現Nur77能夠與SUMO(small ubiquitin-like modifier)化(也稱類泛素化)途徑的泛素結合酶Ubc9競爭性結合磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)，從而抑制PEPCK1的SUMO化修飾及降解[41].Nur77通過與脂肪酸氧化通路的硫解酶TPβ發生相互作用，影響其酶活性，進而調控脂肪酸氧化[42].

此外，Nur77可通過相互作用改變一些蛋白的構象，逆轉這些蛋白的功能.線粒體定位的Nur77可以與B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)發生相互作用，導致Bcl-2的構象發生改變，暴露出其BH3結構域；該結構的變化使得Bcl-2無法再行使抑制凋亡誘導蛋白Bax和Bak的功能，反而抑制另一凋亡抑制蛋白Bcl-xL的功能，使Bcl-2的功能從抗凋亡蛋白逆轉為促凋亡蛋白[15,43].

3 Nur77的翻譯后修飾

常見的蛋白修飾包括磷酸化、乙?；?、泛素化、SUMO化、甲基化、氧化、糖基化等；此外，順反式異構化和二磷酸腺苷(ADP)-核糖基化也是重要的蛋白修飾方式.Nur77蛋白的翻譯后修飾對其發揮生物學功能具有重要影響，如轉錄激活、蛋白相互作用、亞細胞定位、蛋白穩定性等.

3.1 Nur77的磷酸化修飾

Nur77蛋白由598個氨基酸組成，其中含29個蘇氨酸、69個絲氨酸和15個酪氨酸.如此密集的磷酸化氨基酸存在，提示Nur77很可能被不同的激酶磷酸化.組織細胞中Nur77的分子質量常在65～75 ku之間變化，這反映體內Nur77很有可能處于不同程度的磷酸化狀態.在不同的刺激下，不同通路的激酶可以磷酸化Nur77的不同位點(圖2)，使得Nur77發揮不同的生物學功能.

首先，Nur77的磷酸化水平與其蛋白表達水平緊密相關.本課題組的一系列研究表明：Nur77的第95位絲氨酸被JNK1磷酸化后可以增強其與異構酶Pin1的結合，使Nur77發生異構化修飾，抑制Nur77降解，穩定Nur77蛋白[44]；在化療藥物順鉑的刺激下，激活的Chk2能磷酸化Nur77的第88位蘇氨酸，提高Nur77蛋白表達水平[45]；而在茴香霉素刺激下，激活的JNK1能磷酸化Nur77的第95位絲氨酸，介導Nur77發生泛素化修飾，最終導致Nur77降解[46]；當DNA發生雙鏈斷裂后，激活的DNA-PK能磷酸化Nur77的第164位絲氨酸，磷酸化的Nur77進而增強DNA-PK介導的p53磷酸化與轉錄活性[39].

其次，Nur77的磷酸化修飾能夠調控其亞細胞定位.本課題組的研究發現：Akt1可以磷酸化Nur77的N端結構域，抑制Nur77與Bcl-2的相互作用，阻礙Nur77的線粒體定位，最終抑制細胞凋亡的發生[47]；而且腫瘤細胞中高活性的Akt2可以磷酸化Nur77的第533位絲氨酸，使得Nur77滯留于細胞核，阻礙Nur77的線粒體定位[48]；另外，在葡萄糖饑餓的情況下，激活的ERK2能夠磷酸化Nur77的第237位絲氨酸，使得Nur77轉位至線粒體，調節脂肪酸氧化[42].

再者，Nur77的磷酸化修飾可以調控其轉錄激活活性.如前所述，Nur77 DBD的第351位和第354位絲氨酸發生磷酸化修飾可顯著抑制Nur77的轉錄激活活性，而Nur77 TAD的磷酸化修飾也對其轉錄激活活性有影響.本課題組發現，Chk2對Nur77的第88位蘇氨酸磷酸化會抑制Nur77的轉錄激活活性，從而抑制Nur77下游抗凋亡基因的轉錄和表達，促進順鉑誘導的細胞凋亡[45].

此外，Nur77的磷酸化修飾會影響其蛋白相互作用.在巨噬細胞中，Nur77通過與p65(NF-κB的亞基)相互作用抑制NF-κB的活性；而在脂多糖(LPS)誘導下，激活的p38α可以磷酸化Nur77 的第27位和第143位蘇氨酸，阻斷Nur77與p65的相互作用，使Nur77喪失抑制NF-κB 信號通路的能力，導致NF-κB下游炎癥因子激活[49].在腸癌組織中，活化的GSK3β 磷酸化Nur77的第27位和第143位蘇氨酸以及第129位絲氨酸，可削弱Nur77與TCF4、β-Cat的結合，導致Nur77喪失對Wnt 信號通路的抑制作用，進而促進腸癌細胞的生長[32].

3.2 Nur77其他類型的修飾

Nur77除了發生磷酸化修飾外，還可以發生乙?；?、SUMO化、泛素化和氧化等修飾.本課題組的研究顯示，在肝癌細胞HepG2中，乙?；竝300 可以使Nur77 LBD發生乙酰化修飾，抑制Nur77的泛素化修飾，從而穩定Nur77蛋白；而去乙?；窰DAC1則能降低Nur77的乙酰化水平及其蛋白表達水平[50].Nur77被JNK1磷酸化后會發生多泛素化修飾，通過蛋白酶體途徑迅速降解；而E3泛素連接酶Smurf1能夠介導Nur77發生非典型的泛素化，阻礙Nur77 的降解[51].Nur77的SUMO化修飾也能促進其發生多泛素化修飾，進而通過蛋白酶體途徑降解[52].另外，在葡萄糖饑餓的情況下，Nur77的第505位、第551位和第566位半胱氨酸都會發生氧化修飾，進而調節脂肪酸氧化過程[42].

4 Nur77的生物學功能

Nur77幾乎在人體各組織器官均有表達，其功能的紊亂將導致肥胖、糖尿病、心血管疾病、癌癥等疾病.Nur77的生物學功能相當復雜，有的甚至截然相反.例如：Nur77既能促進腫瘤細胞增殖和存活，又能促進腫瘤細胞死亡；既能促進糖異生，又能促進糖酵解.Nur77的這些生物學功能依賴于外界不同的刺激而且具有組織細胞特異性.

4.1 Nur77與腫瘤

Nur77與腫瘤的發生發展密切相關.在不同的腫瘤組織中，Nur77表達水平存在差異，其中Nur77在黑色素瘤、結腸癌、胰腺癌、膀胱癌組織中高表達，而在肝癌、乳腺癌組織中低表達；而且Nur77在不同的腫瘤中發揮的功能有所不同，甚至在同種腫瘤的不同亞型或不同發展時期功能也有差異(表1).

本課題組發現在黑色素瘤中，高表達的Nur77對于黑色素瘤細胞適應葡萄糖饑餓的代謝應激狀態至關重要[42]：在葡萄糖饑餓狀態下，Nur77可維持細胞內還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及還原型谷脫甘肽(GSH)的水平，從而降低葡萄糖饑餓引起的ROS水平升高，促進黑色素瘤細胞的存活.進一步研究發現，葡萄糖饑餓可誘導ERK2的激活并磷酸化Nur77的第237位絲氨酸，該位點的磷酸化作為分子開關，促進Nur77轉運到線粒體，并且在葡萄糖饑餓狀態下Nur77的線粒體定位是細胞存活所必需的，這與以往報道的Nur77在線粒體中促進細胞死亡不同.在線粒體中與Nur77相互作用的新蛋白是脂肪酸氧化最后一步反應的硫解酶TPβ，敲低TPβ或Nur77表達的細胞在葡萄糖饑餓狀態下表現出類似的表型，如NADPH和GSH更容易喪失，而ROS升高更顯著，說明TPβ可促進NADPH的產生而降低ROS水平.進一步機制研究發現，葡萄糖饑餓可誘導TPβ發生氧化修飾，從而抑制TPβ的酶活性，降低脂肪酸氧化，而在這一過程中Nur77比TPβ更容易被氧化，當它與TPβ結合后，通過自身氧化保護TPβ免于氧化引起的酶活性喪失，因而在葡萄糖饑餓狀態下Nur77通過與TPβ結合促進NADPH和GSH的產生，降低ROS水平，使細胞得以存活.小鼠實驗表明，Nur77和TPβ通過提高循環腫瘤細胞在體內的存活率，促進黑色素瘤的轉移.臨床樣本統計分析也表明，Nur77在復發的黑色素瘤中表達水平明顯高于原發的黑色素瘤.因此，Nur77通過保護脂肪酸氧化關鍵酶TPβ免于氧化失活，促進葡萄糖饑餓狀態下的脂肪酸氧化，從而維持細胞中的ROS水平，最終促進黑色素瘤細胞的存活.

表1 Nur77在不同腫瘤中的作用Tab.1 The roles of Nur77 in different tumors

在結腸癌中，Nur77通過負調控Wnt信號通路活性，從而抑制結腸癌的發生[32]：一方面，Nur77通過與β-Cat相互作用，阻斷其定位于Wnt下游基因的啟動子；另一方面，Nur77與TCF4的結合進一步增強TCF4募集轉錄輔抑制因子的能力，進而抑制Wnt下游基因c-Myc和CyclinD1的表達，最終抑制腸道黏膜上皮細胞增殖和腫瘤的發生.在胰腺癌中，高表達的Nur77可以通過促進抗凋亡基因Bcl-2和Survivin的表達，調節細胞內氧化壓力與內質網應激，并調控細胞周期來促進胰腺癌細胞的增殖與存活，最終促進胰腺癌的發生發展[56-58].在膀胱癌中，Nur77通過誘導細胞凋亡以及抑制雄激素受體活性，抑制腫瘤生長[59-60].在肺癌中，TGFβ激活的信號通路能夠磷酸化Nur77并誘導其由細胞核轉運至細胞漿，細胞漿中的Nur77與Axin2/Arkadia/環脂蛋白12(RNF12)形成活性復合體，誘導SMAD7蛋白通過蛋白酶體途徑降解，從而促進肺癌細胞的侵襲和轉移[61].

此外，本課題組通過臨床樣品檢測和統計分析發現，隨著肝癌的惡性程度增高，Nur77表達呈明顯的下調趨勢，且與肝癌患者的預后正相關；利用二乙基亞硝胺/四氯化碳(DEN/CCl4)和鏈脲菌素/高脂飲食(STZ/HFD)兩種肝癌誘導小鼠模型(野生型和Nur77敲除小鼠)，也證明Nur77能夠顯著抑制肝癌的發生發展[41].進一步機制研究表明Nur77通過抑制糖異生通路中限速酶PEPCK1 的SUMO化修飾，從而穩定其蛋白水平，最終促進糖異生、抑制糖酵解，阻斷肝癌進程；但在肝癌發生發展過程中，Nur77啟動子發生甲基化，導致其基因和蛋白表達下調，從而無法發揮抑制PEPCK1的SUMO化及其蛋白降解的功能[41].因此，抑制PEPCK1的SUMO化和提高Nur77的表達水平為肝癌治療提供了一個新方向.在lncRNA研究中，本課題組發現肝癌細胞中Nur77能夠通過轉錄激活lncRNA WFDC21P的方式調控糖酵解抑制肝癌的增殖和轉移，最終抑制肝癌的進程[21].Nur77轉錄激活的WFDC21P能夠與磷酸果糖激酶(PFKP)和M2型丙酮酸激酶(PKM2) 相互作用:一方面，WFDC21P通過與PFKP結合，抑制其四聚化，從而降低酶活性抑制糖酵解過程；另一方面，WFDC21P通過與PKM2結合，將其滯留在細胞漿中，阻礙其進入細胞核發揮轉錄因子的功能[21].本課題組早期研究還發現Nur77通過與轉錄因子p53結合，在轉錄和轉錄后水平調控癌蛋白小鼠雙微體2(MDM2)表達，從而抑制肝癌細胞的生長[65].此外，Yang等[63]發現Nur77可以通過誘導肝癌細胞凋亡的方式發揮抗腫瘤的功能.

在乳腺癌的發生發展過程中，Nur77的功能目前并不明確.為此，本課題組首先在自發性乳腺癌小鼠模型(MMTV-PyVT)和化學試劑乙酸甲羥孕酮(MPA)-7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)誘導的乳腺癌小鼠模型中發現，在兩種小鼠模型中敲除Nur77都能促進乳腺癌的進展，而在Nur77敲除小鼠的乳腺組織中重新特異性地表達Nur77則可以顯著抑制乳腺癌的進程；進一步機制研究表明Nur77在轉錄水平抑制CD36和FABP4的表達，阻斷細胞對外源脂肪酸的吸收，從而抑制乳腺癌細胞的增殖[31].但Zhou等[66]認為Nur77能夠通過激活TGFβ信號通路，促進乳腺癌的侵襲和轉移.因此，Nur77在乳腺癌發生發展過程中發揮的功能及機制還需要更進一步的研究.

4.2 Nur77與腫瘤免疫治療

腫瘤免疫治療是近些年來興起的腫瘤治療方式.正常情況下，機體免疫系統可以識別并清除腫瘤微環境中的腫瘤細胞；但腫瘤細胞具備免疫逃逸的能力，能夠采取不同的方式抑制機體的免疫系統，從而逃避免疫細胞的殺傷.T細胞遇到自身抗原、慢性感染或者暴露于腫瘤微環境后會發生功能紊亂，但導致T細胞功能失調的機制目前并不清楚.Liu等[67]在小鼠體外耐受性T細胞誘導系統中，對全基因組表觀遺傳學和基因表達測序，發現耐受性T細胞、效應性T細胞和調節性T細胞均具有顯著差異，其中Nur77在耐受性T細胞中穩定性高表達；過表達Nur77則可以抑制效應性T細胞的分化，而在耐受性T細胞中敲除Nur77后，T細胞的耐受狀態則被糾正，且對抗腫瘤和慢性病毒感染的能力增強.進一步機制研究表明，Nur77被優先招募到轉錄因子AP-1的結合位點，抑制AP-1的功能域，從而抑制下游效應基因的表達；Nur77結合之后可促進組蛋白H3K27ac的乙?；瑢е履褪芟嚓P基因的表達[67].同時，Chen等[68]也發現在嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)中敲除NR4A1家族能夠獲得更好的療效，可大幅度延長荷瘤小鼠的生存期.此外，Karki等[69]報道表明Nur77拮抗劑Cl-OCH3能夠抑制乳腺癌細胞PD-L1的表達，從而增強腫瘤免疫，抑制乳腺癌的生長和轉移.因此，Nur77有望成為腫瘤免疫治療的靶點.

4.3 Nur77與能量代謝

Nur77在機體能量代謝過程中發揮著重要的作用.Pei等[70]研究表明：在饑餓或胰高血糖素刺激下，小鼠肝臟中環磷酸腺苷(cAMP)信號通路能夠提高Nur77的表達水平；在小鼠原代肝細胞和小鼠肝臟中過表達野生型Nur77，能夠提高糖異生及糖轉運相關基因的表達水平，如G6PC、FBP1/2、GPI1、烯醇化酶3基因(Enolase3)和葡萄糖轉運蛋白2基因(GLUT2)，促進葡萄糖的生成，提高機體血糖水平；而過表達Nur77顯性負作用的突變體，則能夠拮抗這些基因的表達，降低糖尿病db/db小鼠的血糖水平.而且在STZ誘導的小鼠和db/db小鼠的肝臟中Nur77表達上升，提示糖尿病小鼠中高血糖癥狀很可能是由肝臟中Nur77通過促進糖異生過程引起的.本課題組也發現Nur77能夠調控糖異生通路的限速酶PEPCK1蛋白的穩定性來促進肝癌細胞的糖異生，進而抑制肝癌細胞的生長[41].

Nur77不僅在糖異生途徑中發揮調控作用，在糖酵解、糖原分解和磷酸甘油的穿梭轉運過程中也發揮了重要調控作用.如在骨骼肌細胞中，過表達Nur77能夠促進許多糖代謝相關基因的表達，如糖原磷酸化酶基因(GP)、GLUT4和PFK等，從而促進骨骼肌細胞對葡萄糖的吸收和利用[71].

除了葡萄糖代謝外，Nur77也能調控脂類代謝.在小鼠肝臟中瞬時表達Nur77可以抑制固醇調節元件結合蛋白1-c(SREBP1-c)的表達，從而降低血脂含量和肝臟中甘油三酯的合成；在脂肪細胞的前體細胞中，過表達Nur77則可以通過縫隙連接蛋白1(GJA1)和Tolloid樣蛋白1(TLL1)基因顯著地抑制脂肪合成[72].Zhang等[73]研究也表明過表達Nur77能夠使得脂肪細胞前體細胞處于靜息狀態，從而抑制脂肪合成，而敲除Nur77則可以促進脂肪細胞前體增殖以及增強脂肪合成能力.另外，Nur77還影響脂肪分解.Maxwell等[74]發現在骨骼肌細胞C2C12中，β-腎上腺素受體激活劑可以顯著提高Nur77的表達，Nur77進一步促進脂肪分解途徑中相關蛋白的表達，如CD36、解偶聯蛋白3(UCP3)、單磷酸腺苷活化蛋白激酶γ3(AMPKγ3)、GLUT4和Caveolin-3等；而抑制Nur77的表達則顯著削弱脂肪分解.在肝細胞中，Nur77通過抑制低密度脂蛋白受體和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的表達調控肝細胞中的膽固醇代謝[75].

此外，Nur77在線粒體代謝中也起到重要調控作用.在炎性巨噬細胞中，Nur77可以通過抑制異檸檬酸脫氫酶(IDH)的表達以及三羧酸循環的活力抑制炎癥反應，最終抑制動脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病的發生[76].在黑色素瘤細胞中，Nur77通過與線粒體中硫解酶TPβ結合，調控線粒體中脂肪酸代謝過程，最終促進黑色素瘤細胞存活[42].

人類及其他哺乳動物能夠通過維持能量攝取和能量消耗的動態平衡，長時間內保持體重穩定；但當攝取的能量超過自身能量需求時，將導致肥胖.目前，肥胖已經成為威脅人類健康的關鍵因素之一.瘦素由白色脂肪組織分泌，是一種抑制食欲的多肽類激素，作用于下丘腦，通過抑制攝食和增強能量消耗，在機體能量平衡中發揮重要作用.若機體無法響應瘦素，則引起肥胖[77].本課題組發現，Nur77的全身性敲除或下丘腦特異性敲低表達會導致小鼠對瘦素敏感性的顯著下降[78].進一步機制研究表明，Nur77與瘦素下游關鍵信號分子信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)能夠發生相互作用，并且通過募集乙酰轉移酶p300和促進去乙?；窰DAC1解離，提高STAT3的乙酰化水平，進而增強STAT3對下游基因的轉錄調控；隨著小鼠年齡增長，Nur77表達水平低下與小鼠體內瘦素水平上升、攝食增多、血脂增高、能量消耗減少等密切相關，最終導致小鼠肥胖[78].該研究闡明了一條Nur77調控瘦素-STAT3的新信號通路，拓展了Nur77調控代謝的重要功能.由于肥胖患者機體對瘦素抵抗嚴重，Nur77能夠通過增強瘦素信號通路緩解機體對瘦素的抗性，所以Nur77可作為一個潛在的靶點，用于開發預防和治療瘦素抗性、肥胖等相關疾病的新型藥物.

5 靶向Nur77的小分子化合物

Nur77的體內生理性配體至今未被發現.2003年Wang等[79]和Baker等[80]報道了果蠅(Drosophila)中Nur77家族成員Nurr1和Nur77同源物DHR38的晶體結構，發現在其配體結合口袋有6個疏水氨基酸，可能阻擋配體的結合.2005年PDB網站(http:∥www.rcsb.org)公布的晶體結構顯示Nur77與其家族成員的結構類似，但到2008年尚未有直接結合并激活Nur77的化合物被報道.

5.1 第一個Nur77的體外配體Cytosporone-B

為了尋找Nur77的體外配體，本課題組以Nur77應答元件NurRE熒光素酶報告基因為篩選模型，從微生物內生真菌的天然產物庫中篩選到一個可以顯著和特異性激活Nur77轉錄激活活性的酮類化合物Cytosporone-B(Csn-B)[81].通過熒光滴定和圓二色光譜等生物物理方法證實Csn-B與Nur77有很強的結合能力，且特異性地結合在Nur77 LBD；進一步對Csn-B的生物學功能研究表明，Csn-B能通過Nur77 的介導提高小鼠的空腹血糖水平，且部分作用是通過促進Nur77對糖異生相關酶基因的轉錄調控實現的；Csn-B還能夠誘導腫瘤細胞的Nur77轉運出細胞核并定位于線粒體，導致細胞色素c由線粒體釋放到細胞漿，進而誘導腫瘤細胞凋亡，最終抑制裸鼠移植瘤的生長[81].該研究首次發現Nur77激動劑，證實了孤兒核受體的體外配體存在，闡明有些孤兒核受體并非具有真正的配體非依賴性特征.此外，Csn-B也能抑制結腸癌、肝癌和乳腺癌的發生發展[21,32].

除了具有抑制腫瘤的效果外，Palumbo-Zerr等[82]研究發現Csn-B還可以治療各種纖維化疾病，包括皮膚、肺、腎和肝纖維化等.該研究不僅佐證了Nur77介導Csn-B的功能和調控機制，而且展示了Csn-B很好的轉化應用前景.在此基礎上，本課題組以Csn-B為母體結構，進一步合成各種Csn-B衍生物，構建了特異靶向Nur77的小分子化合物庫，從中發現了衍生物TMPA、THPN和PDNPA的獨特功能.

5.2 靶向Nur77抑制小鼠血糖水平的小分子化合物TMPA

AMPK是機體重要的糖代謝調節蛋白，被認為是治療Ⅱ型糖尿病的新藥理學靶點.本課題組發現Nur77可以抑制AMPKα的磷酸化水平，卻不影響其蛋白水平，提示還有其他因子參與抑制AMPKα磷酸化的過程[83].進一步研究表明AMPK的上游激酶LKB1在此過程中發揮重要的作用，Nur77通過與LKB1 結合，使其滯留在細胞核，抑制LKB1與AMPKα的結合，從而阻礙了LKB1對AMPKα的磷酸化；通過化合物篩選，發現小分子化合物TMPA能夠直接結合Nur77，通過與LKB1競爭結合到Nur77的LBD，抑制Nur77與LKB1的結合，導致LKB1釋放，進而磷酸化AMPKα，調控糖代謝；重要的是，在Ⅱ型糖尿病小鼠模型中，TMPA能顯著降低小鼠的血糖水平，并改善小鼠對胰島素的抵抗[83].該研究闡明了一條新的Nur77調控糖代謝的信號途徑，即Nur77通過與LKB1相互作用調控糖代謝.LKB1作為AMPKα的重要上游激酶，直接調控AMPKα的降糖功能，在糖代謝中發揮重要作用[84-87].肝臟特異性敲除LKB1會導致嚴重的高血糖[84].因此，靶向Nur77/LKB1信號通路有望為治療糖尿病的新藥研發提供一個有效的篩選模型[83].

5.3 靶向Nur77誘導自噬性死亡的小分子化合物THPN

激活腫瘤細胞凋亡途徑是當前臨床治療腫瘤的主要方法之一，但長期的藥物使用導致腫瘤細胞對凋亡誘導產生抵抗，嚴重影響臨床腫瘤治療的效果.因此，尋找其他有效并可運用于臨床的腫瘤治療方式至關重要.營養缺乏時細胞通過自噬提供能量，維持自身存活；但過度自噬引起細胞器的過量清除則會導致細胞死亡.2014年本課題組報道了Nur77介導的線粒體自噬選擇性地誘導細胞死亡，從而抑制黑色素瘤的發生發展[88].在小分子化合物THPN的誘導下，Nur77被Nix蛋白攜帶到線粒體，在線粒體外膜轉位酶(TOM)復合體的幫助下進入內膜與腺嘌呤核苷酸轉位酶1(ANT1)結合，使線粒體通透性轉運孔道開放，引發線粒體膜去極化，導致大量的線粒體受損，繼而誘發自噬對線粒體的過量清除，最終導致黑色素瘤細胞走向不可逆的自噬性死亡；小鼠模型進一步證實化合物THPN通過Nur77誘導的細胞自噬性死亡，能夠很好地抑制黑色素瘤的發生發展和轉移[88].該研究不僅闡明了Nur77通過線粒體信號通路參與細胞自噬性死亡誘導的新機制，還發現通過誘導細胞自噬性死亡能夠克服黑色素瘤細胞對凋亡的普遍抗性，為黑色素瘤的臨床治療開辟了新思路.

然而，THPN對其他腫瘤卻沒有作用.為了進一步拓展THPN的應用，本課題組深入探討了阻礙THPN誘導非黑色素瘤細胞自噬的根本原因和機制[48]：在許多非黑色素腫瘤細胞中激酶Akt2呈現高活性狀態，通過磷酸化Nur77的第533位絲氨酸使得Nur77滯留于細胞核，阻斷THPN誘導的胞漿Nur77與Nix結合，進而抑制Nur77線粒體定位及由此產生的線粒體功能受損，最終阻斷細胞自噬性死亡.因此，THPN聯合Akt抑制劑或者敲低Akt2表達就可以在細胞和動物水平上抑制不同類型的腫瘤生長.在此基礎上，以THPN為母體結構，通過解析THPN-Nur77共結晶結構，進一步優化化合物結構，合成了不同的THPN衍生物，最終獲得一個誘導自噬抑制腫瘤生長等性能高于THPN的化合物[48].該研究不僅確定了干擾THPN誘導腫瘤細胞自噬性死亡的具體分子，闡明了一條Nur77與Akt調控腫瘤耐藥性的新途徑，更為拓展THPN的應用范圍和研發誘導自噬抑制腫瘤的新型藥物提供了重要的理論基礎.

5.4 靶向Nur77抑制膿毒癥引起炎癥死亡的小分子化合物PDNPA

膿毒癥(即敗血癥)是感染后繼發的一種全身炎性反應綜合癥，嚴重時導致死亡.本課題組首先在內毒素LPS及盲腸結扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)誘導的小鼠膿毒癥模型中發現，全身敲除Nur77的小鼠與野生型小鼠相比具有高敏感性和高死亡率，并伴隨大量的炎癥因子釋放及組織器官嚴重損傷；進一步機制研究發現，Nur77抑炎功能通過與NF-κB亞基p65結合阻斷其結合到DNA，由此抑制NF-κB轉錄活性以及下游炎癥因子的激活，但在LPS刺激下，激活的p38α會磷酸化Nur77，使其喪失抑制NF-κB信號通路的能力[49].因此，阻斷p38α與Nur77結合和磷酸化可以使Nur77更好地發揮功能.本課題組從自建的化合物庫中篩選到以Nur77為靶點的小分子化合物PDNPA，其能夠明顯抑制NF-κB的轉錄功能，從而激活Nur77抑炎功能；共結晶結構及分子實驗證實PDNPA能夠結合到Nur77 LBD，阻斷p38α的結合和Nur77磷酸化，使之發揮抑炎功能[49].該研究揭示了Nur77在膿毒癥中發揮的新功能，闡明了其調控炎癥的新途徑，并發現了具有明顯抑炎功能的化合物.

此外，廈門大學藥學院張曉坤課題組2017年發現雷公藤素可以與Nur77結合，導致Nur77由細胞核轉運至受損的線粒體，繼而與腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)相互作用而引起Nur77發生泛素化修飾，進而被溶酶體上的p62識別并通過細胞自噬清除受損的線粒體，最終達到抑炎效果[89].這一研究不僅為Nur77介導細胞自噬提供了新的依據，而且為Nur77調控炎癥提供了新的理論支持.

除上述靶向Nur77研究外，Stephen課題組根據indole-3-carbinol代謝物也設計合成了一系列的小分子，包括C-DIMs(methylene-substituted diindolylmethanes)及其衍生物；這些小分子能夠以Nur77依賴和非依賴的兩條途徑發揮抗腫瘤活性，既可以通過抑制Nur77的轉錄活性誘導細胞凋亡，也可以通過不依賴于Nur77的方式促進內質網應激誘導細胞凋亡[90].還有研究表明花生四烯酸[91]和前列腺素A2[92]能夠結合Nur77 LBD，調控Nur77的轉錄活性.

6 總結與展望

Nur77通過調控靶基因轉錄、蛋白相互作用以及亞細胞定位等方式在不同的疾病中發揮著重要作用.首先，在不同的腫瘤或者同種腫瘤的不同亞型中，甚至同類型腫瘤發展的不同階段，Nur77扮演的角色不盡相同，既能作為原癌基因發揮促癌作用，也能作為抑癌基因執行抑制腫瘤的功能；而且Nur77是抗腫瘤的重要藥物靶點，抗腫瘤藥物通過Nur77介導可以誘導細胞凋亡以及自噬性死亡而抑制腫瘤生長.其次，Nur77通過調控糖酵解、糖異生、糖原分解、脂代謝和線粒體代謝等生物學過程，參與機體的血糖以及能量平衡的調節.此外，Nur77在纖維化疾病以及炎癥性疾病中也發揮重要調控作用.綜上可見，Nur77在生命過程中發揮著多樣且復雜的功能(圖3).

圖3 Nur77的修飾、生物學功能及小分子化合物的作用機制Fig.3 Nur77 modification,biological functions and the mechanism of small molecule compounds

目前，臨床腫瘤治療的主要方式是手術切除、化療法和免疫療法.大部分的化療藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤的發生發展，長期使用導致許多腫瘤細胞產生凋亡耐受，限制了其進一步使用.因此，人們開始通過誘導腫瘤細胞新的死亡方式來篩選新的抗腫瘤藥物.THPN通過Nur77誘導細胞過度自噬清除線粒體，最終導致黑色素瘤細胞走向不可逆的自噬性死亡，克服了黑色素瘤細胞對凋亡的抵抗[88]，為治療黑色素瘤和臨床藥物的篩選提供了新思路.

免疫療法為癌癥的治療帶來很大的希望，但是其應用有限，在一些實體瘤中發揮作用不夠理想.T細胞是殺傷腫瘤細胞的主要執行者，但當T細胞暴露于腫瘤微環境之后會功能紊亂，呈現對腫瘤細胞耐受的狀態；而Nur77在調控T細胞耐受的過程中發揮關鍵作用，敲除Nur77能夠逆轉T細胞的耐受狀態[67]，因此Nur77可能成為腫瘤免疫治療的新靶點.以Nur77為靶點，繼續篩選既能誘導腫瘤細胞死亡又能通過抑制Nur77的功能克服T細胞耐受狀態，進而增強腫瘤免疫的藥物，有望成為腫瘤免疫療法的新方式，同時也能夠為拓展免疫療法的應用提供新思路.

Nur77是一個孤兒核受體，至今其內源性配體尚未發現，但本課題組通過深入系統的研究發現了一系列Nur77體外配體，能夠結合到Nur77 LBD發揮調控作用，如通過誘導腫瘤細胞凋亡或者自噬性死亡抑制腫瘤、提高AMPKα磷酸化降低血糖，以及抑制NF-κB轉錄功能抑制炎癥等.長期以來，人們主要篩選靶向核受體經典配體結合口袋并調控其轉錄激活活性的小分子，然而越來越多的研究證實核受體具有轉錄活性非依賴的生物學功能.本課題組的系列研究提示，針對核受體發揮功能的信號通路，篩選阻斷或增強核受體與關鍵蛋白相互作用的小分子，有望成為篩選核受體靶向藥物的新方向.

在核受體龐大的家族成員中目前一半左右的成員還是孤兒核受體，可能由于技術手段的限制，暫時沒有分離和檢測到它們的內源性配體.雖然體外激動劑與拮抗劑的發現為研究孤兒核受體的功能提供了強有力的工具，但是尋找和鑒定其真正的內源性配體仍然是一項重要和艱巨的研究工作.因此，發展新的分離技術和開創新的檢測方法至關重要.