病毒樣顆粒在腫瘤治療中的研究進展

任 磊，程科滿，張 強，王楚凡，杜 濤

(廈門大學材料學院，福建省高校生物醫學工程重點實驗室，福建 廈門 361005)

20世紀60年代中期，病理學家在被病毒感染的人類和動物組織樣本中首次觀察到類病毒納米顆粒[1-3]，這些納米顆粒與病毒形態相似但沒有傳染性，將其稱為病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs).進一步研究發現，VLPs是一種由病毒蛋白重復排列而成的規則的中空蛋白顆粒結構，能夠展示病毒表位，但不包含病毒遺傳物質，不具有復制和感染特性，多數呈球狀或管狀[4].相比于其他納米載體，VLPs具有以下幾點優勢：1) 通過重組蛋白表達即可實現簡單、經濟、可控的大規模生產；2) 組成和結構均一，易于在特定位置進行功能化改造；3) 在體內外均具有生物相容性和生物可降解性；4) 解聚重組能力和空腔結構易于進行藥物包載[5-6].這些特性引起了人們對開發VLPs作為疫苗和藥物遞送載體的濃厚興趣.大量研究證實VLPs具有較高的免疫原性，能夠充分激活機體免疫反應，促進B細胞活化并釋放抗體[4,7-13]，并且納米尺度的VLPs可以被抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APCs)大量攝取并降解，從而活化T細胞[14-16].VLPs除了作為疫苗應用外，利用VLPs的空腔結構和可修飾性可以包裹或展示一些小分子藥物，從而實現靶向遞送，極大改善了藥物的體內分布和療效[6,17-20].在過去的50多年里，VLPs已經成為生物醫學研究中的重要工具(圖1)[21-26].本文綜述了VLPs在腫瘤治療中的研究進展，著重介紹了VLPs作為腫瘤藥物遞送載體和疫苗的設計.

1 VLPs的免疫原性

圖1 VLPs發展的各個階段概覽Fig.1 An overview of various stages in the development of VLPs

T細胞在抗癌免疫反應中發揮著重要作用.APCs通過免疫組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)可以將抗原遞呈給T細胞識別，其中由MHC Ⅰ遞呈的抗原可以刺激并活化CD8+細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)直接殺傷腫瘤細胞，此外，CTL產生的細胞因子能夠形成促炎癥環境進而殺傷腫瘤細胞[27].由MHC Ⅱ遞呈的抗原可以刺激并活化CD4+T細胞，該細胞的不同亞型在抗腫瘤反應中的作用不同：Th1(CD3+CD4+干擾素γ(IFNγ)+)細胞通過分泌促炎癥細胞因子，輔助CD8+CTL裂解腫瘤細胞[28];而另一種免疫抑制細胞Tregs(CD3+CD4+Foxp3+)則通過分泌白介素10(IL-10)和腫瘤生長因子β(TGF-β)等細胞因子，抑制CTL增殖并降低炎癥反應[29-30].因此，加強Th1細胞和CTL的激活是抗腫瘤疫苗研制的關鍵.VLPs能夠引起一定固有免疫，且易于進行基因工程改造[31-36]，已被證實可以有效誘導Th1細胞和CTL的增殖和分化[37-39]，因此通過基因工程改造VLPs或用VLPs包裹免疫刺激類藥物即可實現多種免疫反應協同抗腫瘤的療效.已有研究表明，展示T細胞表位的VLPs或將VLPs與APC刺激劑聯合使用可刺激有效的Th1細胞和CTL應答.例如：當噬菌體衍生的Qβ-VLP攜帶Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的配體(如RNA或富含未甲基化CG基序的寡核苷酸(oligonucleotides rich in unmethylated CG motifs,CpGs)等)時，它們可以刺激CTL和Th1細胞應答；但當它們攜帶多聚谷氨酸(polyGLU)時，則無法檢測到有效的應答[40-41].由于VLPs的特性，一些內核富含精氨酸的VLPs(如HBcAg VLPs)在宿主細胞中表達時會聚集在核酸周圍[41]，這也為VLPs作為核酸遞送載體奠定了一定基礎.目前，VLPs可以用于遞送不同的TLR配體，如CpGs(TLR-9配體)、polyGLU、單鏈核糖核酸(single-stranded ribonucleic acid，ssRNA)(TLR 7/8配體)或雙鏈核糖核酸(double-stranded ribonucleic acid，dsRNA)(TLR-3配體)，并且VLPs可以在這些TLR配體存在的情況下實現解聚和重組，解聚時大量配體被正電性的精氨酸富集末端吸引，重組后包裹進VLPs內部[42-46].

VLPs除了能夠引起T細胞相關的反應外，也能夠引起B細胞相關的免疫反應.VLPs被認為是一種功能強大的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，它能被B細胞的受體識別，并使B細胞足以獨立激活CD4+T細胞并長時間維持其功能[7,47].夏寧邵教授團隊[48-49]應用大腸桿菌(Escherichiacoli)原核表達系統研制出多種VLPs疫苗，如2012年上市的全球首個戊肝疫苗和2020年上市的人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗(即宮頸癌疫苗)，在真核表達系統之外開辟了疫苗研究的新途徑.VLPs高度重復的結構可以被多個B細胞受體(B-cell receptor，BCR)識別并向B細胞傳遞刺激信號，在引起B細胞免疫反應中有很大優勢[50-51].此外，VLPs表面可用于展示多達300～400個肽段，誘導抗體反應[52].VLPs還能展示腫瘤細胞表面的特異性抗原人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)蛋白，以誘導B細胞反應，刺激特異性抗體的產生，最終提高腫瘤組織的炎癥水平，增強CD4+和CD8+T細胞的活性[53-54].

VLPs類似于天然病毒，通常比亞單位或重組蛋白免疫原更具免疫原性[55-56].研究發現VLPs可以被巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)等細胞攝取，激活固有免疫，之后大量細胞因子的釋放和抗原的交叉遞呈可以進一步激活適應性免疫反應[37].VLPs的球狀粗糙多凸起的表面，兼具流動性和柔韌性，利于抗原受體結合，是被APCs有效攝取的關鍵[57].VLPs被APCs攝取加工后可以被MHC Ⅱ或MHCⅠ分子呈遞于細胞表面，同時還能刺激DCs成熟并遷移到淋巴結遞呈抗原，從而激活T細胞.此外，外來抗原一般只能由MHC Ⅱ分子遞呈[58-59]，而VLPs與其他外源抗原不同，它可在APCs內經歷交叉提呈，在沒有感染細胞的情況下也能有效地被MHC Ⅰ分子遞呈[60-61].因此，VLPs能有效刺激CD4+T淋巴細胞和CTL增殖.綜上，VLPs作為腫瘤疫苗具有先天優勢，其免疫原性可以有效激活機體產生免疫反應，但是作為藥物遞送載體時往往需要通過一些手段去降低VLPs的免疫原性，使其在體內能有效遞送藥物.

2 VLPs作為藥物遞送載體在腫瘤治療中的應用

VLPs的粒徑有利于細胞胞吞，還兼具生物可降解性和安全性，通過基因工程或化學修飾即可對其3個不同界面(蛋白顆粒的外部、內部和亞基之間)進行功能化改造[39]，這使其成為理想的藥物遞送載體(圖 2).Ao等[62]利用人類免疫缺陷病毒群體特異性抗原(HIV-Gag)可自組裝成VLPs這一特點，設計了融合半胱氨酸蛋白酶8(caspase 8)的Gag-CASP8融合蛋白，并與水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)形成偽病毒Gag-CASP8-VLPs.VSV-G可介導顆粒有效進入細胞，增強其在胞漿內傳遞，有效地將caspase 8遞送到細胞內部，誘導腫瘤細胞凋亡，進而抑制乳腺腫瘤的生長.

圖2 VLPs作為藥物遞送載體在腫瘤治療中的應用Fig.2 The application of VLPs as drug delivery carriers in tumor therapy

病毒結構蛋白內部常帶有對核酸具有親和性的氨基酸殘基，以實現更穩定地包裹病毒遺傳物質的作用.因此，以病毒結構蛋白為主體的VLPs可作為基因藥物的良好載體[63].Lin等[64]使用人JC多瘤病毒(JCPyV)來源的VLPs作為基因遞送載體，將攜帶肺癌特異性自殺基因啟動子(SP-B)和CD59特異性短發夾RNA(shRNA)的表達質粒(pSPB-shCD59)有效地遞送到肺癌細胞內，增強了補體依賴性細胞毒性，并有效地抑制了肺部腫瘤的生長.本課題組已實現了VLPs表面氨基酸序列的靶向改造，如在VLPs表面融合表達腦靶向肽(TGN)[65]或整合素受體靶向肽(RGD)[66]，同時通過共價或非共價作用裝載治療分子，從而更有效和精準地將小分子化療藥物遞送至腫瘤部位，實現良好的抗腫瘤療效.

VLPs作為腫瘤影像探針平臺具有一定的臨床應用前景，多種病毒來源的VLPs診療平臺也已有多方面深入研究[67-68].如有研究者將多種光敏劑、熒光染料等裝載到酸漿斑駁病毒(PhMV)來源的VLPs內部或修飾在VLPs表面，VLPs不僅能有效地提高熒光藥物的化學穩定性，還能增加腫瘤細胞對藥物的攝取[69].Kines等[70]將酞菁光敏劑(IRDye 700DX)偶聯的HPV VLPs應用于腫瘤的治療，在體外實驗中發現功能化VLPs(AU-011) 能夠有效抑制人源腫瘤細胞的生長，在小鼠和兔黑色素瘤皮下模型中均展示出優異的抗腫瘤療效.Ji等[71]利用鐵蛋白納米顆粒的組裝特性，將6-羧基熒光素(FAM)標記的FAP-α(fibroblast activation protein-α)底物肽及其對應的猝滅劑(BHQ)分別偶聯至鐵蛋白納米顆粒，成功制備了體內響應納米熒光探針，用于FAP-α酶高表達的腫瘤檢測.本課題組[72]將光敏劑吲哚菁綠(ICG)包載到表面融合了RGD的乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)VLPs內部，不但可作為熒光和光聲成像的影像探針，還利用ICG的光動力和光熱作用實現了腫瘤的有效治療.

在VLPs表面用長鏈高分子進行修飾可以起到有效延長體內循環時間、降低免疫原性、增加穩定性、增強滲透性和滯留(enhanced permeability and retention，EPR)效應等作用[73].Shukla等[74]使用PEG修飾馬鈴薯X病毒(PVX)和豇豆花葉病毒(CPMV)的VLPs，以降低其免疫原性，結果表明，修飾后的VLPs在小鼠異位腫瘤部位有更高的滲透和積聚，PEG的修飾增強了VLPs的腫瘤歸巢和EPR效應，使其成為有潛力的癌癥藥物遞送和成像應用平臺.

圖3 VLPs作為疫苗在腫瘤治療中的應用Fig.3 The application of VLPs as vaccine in tumor therapy

綜上所述，由于VLPs內部可以包裹和保護敏感化合物，外部可以進行修飾，具有容易被修飾的優點，所以VLPs作為藥物載體可以實現精確陣列展示大分子或負載小分子藥物.良好生物相容性和易于改造修飾的特性使VLPs發展成為一種良好的靶向藥物遞送系統，有助于進一步擴展和改進現有的藥物遞送載體體系.

3 VLPs作為疫苗在腫瘤治療中的應用

VLPs具有天然的免疫原性，以其作為腫瘤疫苗被廣泛開發和設計(圖 3).在其表面展示外源抗原的技術已被用于生產針對病原體的疫苗，并可有效地打破自身免疫耐受狀態，從而啟動對功能失調蛋白質的免疫反應[75-76].疫苗接種和其他形式的免疫治療對于癌癥和慢性病的預防和臨床治療上已經有很多應用[75-78].通過基因工程技術，在VLPs多肽結構單元的基因中嵌入一些功能蛋白基因片段，如將VLPs多肽結構單元與抗原融合表達，實現體內的腫瘤免疫治療.Zheng等[79]通過將CD274的siRNA整合到HPV16-L1蛋白中，構建了一種基于具有免疫檢查點阻斷功能的納米疫苗.HPV16-L1蛋白可以激活Ⅰ型IFN介導的先天免疫，siRNA可有效降低免疫檢查點CD274的表達，從而保護T細胞的活化和增殖，進而實現協同治療效果.Hoopes等[80]將來源于CPMV的VLPs(CMV)與放射治療相結合用于黑色素瘤模型的治療，在放療方案中加入CMV不僅可增加腫瘤內免疫細胞浸潤，而且還可以顯著提高腫瘤局部的炎癥環境，進而放大腫瘤釋放抗原所產生的免疫效果，顯著抑制腫瘤生長，并且能有效抑制腫瘤的轉移.

同樣地，VLPs的表面還可以與腫瘤抗原進行融合表達，作為腫瘤疫苗進行免疫治療.Kurg等[81]將3種不同的黑色素瘤抗原MAGEA4、MAGE10和MCAM蛋白融合在逆轉錄病毒Gag蛋白中，自組裝形成VLPs，該重組抗原在哺乳動物細胞中能夠被遞呈，表明攜帶重組抗原的逆轉錄病毒Gag VLPs有望激活腫瘤抗原特異性免疫反應.Simons等[82]用前列腺干細胞抗原(PSCA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP-1和PAP-2)這2種前列腺癌相關腫瘤抗原，以及前列腺癌特異性T細胞刺激物(SPAS-1) 的多肽修飾牛乳頭瘤病毒L1蛋白，與病毒上的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，組成新型VLPs疫苗；該疫苗單獨或聯合PD1抗體治療可顯著抑制腫瘤生長，提高腫瘤組織中CD3+和CD8+T細胞浸潤，表明牛乳頭瘤VLPs是一種在轉移性前列腺癌患者中具有應用潛力的疫苗載體.Palladini等[54]通過共價修飾，將完整的HER2的胞外結構域與來源于化膿性鏈球菌(Streptococcus)的纖維連接蛋白SpyCatcher制備成融合抗原，并將融合抗原(SpyCatcher-HER2)附著到AP205噬菌體來源的VLPs表面(表面融合有SpyCatcher對應的標簽SpyTag)；該疫苗有效地克服了B細胞的免疫耐受，產生高滴度且具有治療效力的HER2抗體，有效防止HER2呈陽性的乳腺腫瘤生長，在預防和治療自發型HER2陽性腫瘤中具有重要意義.該研究結果也證實了利用VLPs平臺來開發非傳染性疾病疫苗的優越性.

鐵蛋白納米顆粒作為藥物遞送體系被廣泛研究[83].Wang等[84]將分子膠水技術結合到鐵蛋白納米顆粒的設計中，成功制備出能夠快速展示病毒或腫瘤抗原的鐵蛋白納米疫苗平臺；該納米疫苗能夠引流至淋巴結并被DCs大量攝取，增強了抗原特異性免疫反應，最終有效抑制HPV16和MC38腫瘤的生長.本課題組[85]將模式抗原雞卵白蛋白片段(OVA275-264)通過基因工程技術展示在HBc VLPs表面；OVA-HBc VLPs免疫小鼠后，其體內能夠產生較強的CTL反應.OVA-HBc VLPs作為腫瘤預防性疫苗，可顯著延緩腫瘤生長；作為治療性疫苗，在聯合低劑量紫杉醇(paclitaxel，PTX)后，展現出有效的抗腫瘤作用.

VLPs疫苗已在人群中廣泛接種，并經受了時間的考驗，具有生物安全性高、轉化潛力大的優點.與減毒疫苗相比，VLPs的另一個優點是可進行多功能化修飾，包括化學結合、基因重組等方法，通過與其他疾病的免疫原性分子結合即可獲得具有高免疫原性的疫苗.由于VLPs不通過感染進入宿主細胞，并且抗載體的免疫對VLPs疫苗影響很小[86]，使其在腫瘤治療中具有樂觀的應用前景.

4 總結與展望

基于VLPs的可修飾性、穩定性、生產簡單和獨特的免疫原性，VLPs在腫瘤疫苗開發和藥物遞送領域具有良好的應用前景.一方面，VLPs的可修飾性和空腔結構可用于抗腫瘤藥物的體內遞送，對VLPs進行靶向修飾可實現藥物的靶向富集；也可用PEG等免疫惰性物質修飾VLPs來降低免疫原性，從而促進藥物在體內的循環時間；VLPs通過一定的工程化改造(如插入酶響應多肽)即可實現藥物在靶位置的控制釋放.另一方面，VLPs本身就具有較高的免疫原性，可引起機體的先天免疫，偶聯或包載免疫刺激物(免疫佐劑)可進一步提高機體的炎癥水平，增強T細胞活化；VLPs融合腫瘤抗原后還能引發腫瘤抗原特異性免疫反應，進一步提高抗腫瘤療效.總而言之，嵌合型VLPs的設計在很大程度上解決了腫瘤抗原和抗癌藥物的遞送問題.VLPs是一種極其強大的“分子工具箱”，已經在腫瘤治療中取得可喜的進展，在未來的設計中應該充分發揮VLPs目前已有的優勢，融合更多的學科技術豐富其功能，從而加快基于VLPs的腫瘤治療的智能化、個性化發展.