改良羊水細胞培養方法在產前診斷中的應用

杜升燁，黃憲霞，王紅梅

濟南市人民醫院重癥產科，山東濟南 271100

在目前臨床醫學中檢測產前染色體疾病的主要方式是羊水細胞培養方式[1]。由于羊水細胞培養的方式難度比較大、操作技術要求比較高、羊水細胞培養的時間長和培養成功率不高等問題，因此很多醫療機構均未實施羊水細胞檢測的工作[2-4]。隨著科學的發展，醫療水平也隨之提高，近年來，許多研究團隊研究和改良了羊水細胞培養技術[5]。該文為探討分析改良羊水細胞培養方法在產前診斷中的應用效果，便利選擇2019 年1—11 月來該院婦產科臨床資料上顯示有遺傳性染色體不良妊產或高危的200 例孕婦作為研究對象，實施羊膜腔穿刺術抽取羊水，然后使用改良的傳統羊水培養方式和改良的原位細胞培養方式進行培養，研究結果取得了較高的成果，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

便利選擇來該院婦產科臨床資料上顯示有遺傳性染色體不良妊產或高危者等200 例孕婦作為研究對象。研究對象的年齡 22～45 歲，平均年齡（39.32±2.35）歲；孕周為 18～32 周，平均孕周為（28.75±1.45）周。

1.2 納入標準

①臨床診斷顯示遺傳性染色體不良妊產、高危者、高年齡或B 超顯示異常的孕婦； ②均無嚴重并發疾病和嚴重感染性疾病； ③該次研究經過了醫院倫理委員會的批準和同意；④患者無行為、組織和認知障礙；⑤患者和家屬同意后對患者實施羊膜腔穿刺術。

1.3 方法

使用 B 超（B-scan ultrasonography）進行定位，然后在無菌的情況下進行穿刺操作[6]。按照改良的傳統羊水培養和改良的原位細胞培養的操作方法，分別對患者實施羊水采集。

改良的傳統羊水培養： 對采取的羊水細胞進行離心操作并將上清液丟棄，保存5 mL 羊水細胞層，使用滴管接種在的培養液中，放入培養箱進行培養，4 d 后進行采集，一般5 d 換1 次培養液。在收集前2 h 使用秋水仙素滴入培養皿中，然后靜止放置2 h，將羊水細胞停止分裂。

①針對胎質羊水的處理方式： 羊水的沉淀中含有大量的胎質羊水，細胞培養96 h 后，觀察羊水細胞是否出現貼壁的現象，出現貼壁現象后搖動培養皿對培養皿進行換液處理。

②針對嚴重血性羊水的處理方式： 在羊水細胞培養過程中如果出現血性羊水，則往羊水中加入無菌肝素，觀察羊水細胞是否出現貼壁的現象，出現貼壁現象后搖動培養皿對培養皿進行換液處理。

③針對羊水細胞克隆老化的處理方式： 采用原瓶消化法的方式來處理羊水細胞克隆老化。將培養液中的上清液倒出，使用無菌生理鹽水對細胞面進去清理，然后使用生理鹽水胰酶進行消化，直至細胞脫落后加入新的培養液，然后放入培養皿中進行培養，48 h 后收取培養皿細胞。

④針對羊水細胞的收獲方式： 沿著培養皿輕刮細胞，并使用吸管對克隆細胞進行收取[7]。然后使用生理鹽水對細胞進行沖洗，將收取的細胞進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL。

低滲：將5 mL 的氯化鉀加入懸液管中，混勻后放入37℃的水浴箱中低滲10 min，之后進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL，加入固定液搖勻，然后進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL，再進行固定，1 h 后放入冰箱中。

滴片： 進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL，然后加入固定液，然后將1 滴懸液滴入玻璃片上，風干后，使用顯微鏡對觀察細胞中染色體的情況。

改良后的原位細胞培養： 首先進行離心實驗并丟棄上清液保留沉淀0.5 mL，加入一定量的羊水細胞培養液，搖勻后放入培養箱中實施培養。2 d 后進行采集，一般5 d 換1 次培養液。

低滲： 丟棄上清液并使用生理鹽水對細胞面進行清洗，連續清洗2 次后，將氯化鉀（0.075 mol）加入低滲30 min；預備固定，將培養液中加入定量的固定液，搖勻后靜置5 min。固定：倒出低滲的液體和預備固定的液體，然后加入固定液，搖勻后靜置30 min 后，倒出固定液，連續固定2 次即可。

顯帶：在76℃下對研究對象進行烤片，然后使用生理鹽水胰酶進行消化，將G 顯帶實施染色，根據相關標準對核型進行分析。

1.4 統計方法

應用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，計數資料以頻數和百分比（%）表示。

2 結果

①對200 例進行培養，一次性羊水穿刺培養成功了180 例，成功率為90.00%，二次羊水穿刺成功培養了10 例，成功率為5.00%，總培養成功了190 例，總成功率為95.00%，其中培養的時間為4～6 d，收獲最短的時間為4 d，最長的時間為6 d。其中培養失敗的6 例因為細胞不貼壁現象。

②在衛生部門相關規定的基礎上，使用改良的傳統羊水培養方式和改良的原位細胞培養方式進行培養，延長了羊水細胞檢查的孕周時間，而且有效減少了胎兒和孕婦實施染色體檢查的危險，胎兒和孕婦的生命安全也得到了有效的提高，見表1。

③對可行染色體核型190 例分析發現，出現染色體異常核型現象的有18 例，且染色體異常檢出率為9.47%，其中，平衡易位有 5 例，占染色體異常的27.80%；三體綜合征有7 例，占染色體異常的38.89%；其他結構異常的6 例，占染色體異常的33.33%。

表1 不同培養方式下羊水細胞培養的效果

3 討論

羊水細胞培養是在產前診斷的一種綜合性的技術手段[8]。羊水細胞是否可以高質量的培養和收獲是實施羊水染色體核型分析最重要的部分。在傳統培養過程中，將沉淀的細胞都接種在培養皿中，并使用秋水仙素培養后對細胞實施收獲[9]。然后將細胞實施離心等操作。在這些實驗操作的環節中，由于培養的時間比較長，因此極容易造成污染，一旦發生污染現象，就無法進行補救。而且在傳統羊水細胞培養過程中，大大小小的操作非常多，有可能因為一個微小的操作失誤就會導致實驗不成功，從而無法得出正確的結論。

由于導致羊水細胞培養失敗的因素有很多。近年來有研究對象提出，在培養過程中將培養液分為兩部分，并加入新鮮的培養液進行培養[10]。還有研究提出[11]，將培養皿放入冰箱中然后實施分離細胞進行培養等。提出的方法均存在者不同程度的局限性。該次研究為了進一步分析改良羊水細胞培養方法在產前診斷中的應用效果，選擇來該院婦產科臨床資料上顯示有遺傳性染色體不良妊產或高危者等孕婦作為研究對象，實施羊膜腔穿刺術抽取羊水，然后使用改良的傳統羊水培養方式和改良的原位細胞培養方式進行培養，研究結果顯示，對200 例進行培養，培養成功了190 例，成功率為95.00%，其中培養的時間為4～6 d。對可行染色體核型190 例分析發現，出現染色體異常核型現象有18 例，且染色體異常檢出率為9.50%。其中，平衡易位有5 例，占染色體異常的27.80%；三體綜合征有7 例，占染色體異常的38.89%；其他結構異常的6 例，占染色體異常的33.33%。充分證明了改良的傳統羊水培養方式和改良的原位細胞培養方式能夠有效預防染色體異常患兒的出生，從而響應了我國優生的政策，改善了因染色體異常患兒造成的不必要的負擔。

該次改良羊水細胞培養方式比傳統羊水細胞培養方式不同的是針對不同孕周實施相應的檢測和培養，優點：①操作前對樣本實施留存操作，避免出現原材料的浪費現象[12]。②對處理脫落細胞的中優化了操作流程。③優化了對染色體的收獲操作，大大降低了交叉污染的概率也提高了試驗的效率。④比傳統羊水細胞培養方式操作步驟少，在操作重對脫落的細胞直接實施低滲，從而減少了離心操作，縮短了實驗時間，而且改良后羊水細胞培養方式成功率比傳統的羊水細胞培養方式高。

該次研究數據與李付廣等人[3]研究結論相符，對羊水細胞培養135 例，全部一次性羊水穿刺培養成功,成功率為100%。對可行染色體核型135 例分析發現，9 例異常染色體核型（6.6%）、12 例多態性（8.9%）。對 80 例實施臍帶血細胞培養，培養成功的有78 例，成功率為97.5%,對可行染色體核型78 例分析發現，檢出異常核型 8 例（10.3%）、多態性 8 例（10.0%）。充分證明了改良羊水細胞培養技術對于產前診斷中有著積極的作用。

綜上所述，改良的傳統羊水培養方式和改良的原位細胞培養方式均提高了收獲的成功率，減少了細胞培養的時間，且檢測分析的染色體核型比較多。因此改良的傳統羊水培養方式和改良的原位細胞培養方式能夠提高培養率，提高對胎兒染色體疾病臨床診斷的準確率，因此改良羊水細胞培養方法值得在臨床產前診斷中應用。