建立滿山紅葉HPLC 指紋圖譜并測定杜鵑素含量

曹 菁，王淑敏，宋鳳瑞，皮子鳳

（1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，長春 130022；3.中藥化學與質譜吉林省重點實驗室，長春 130022）

滿山紅來源于杜鵑花科杜鵑屬植物興安杜鵑（Rhododendron dauricum L.）的葉。滿山紅在治療咳喘方面效果突出[1]，常用來治療慢性氣管炎，慢性支氣管炎等[2]。滿山紅以黃酮類、香豆素類、有機酸類、揮發油類等化學成分為主，其中藥效作用突出的是黃酮類[3]，包括杜鵑素、山奈酚、金絲桃苷等。中藥材含有的化學成分復雜，影響其化學成分種類和含量的因素也很多，因此需要規范中藥材的質量標準。中藥指紋圖譜可以使得到的有用化學信息最大化，起到把控中藥產品的質量的作用[4]。因此建立中藥指紋圖譜意義重大，也為后續中藥材研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

美國Agilent 公司的1260 型高效液相色譜儀；美國THERMO 公司的G10S UⅤ-Ⅴis 型紫外分光光度計；昆山市超聲儀器有限公司的KQ-250DE 型醫用數控超聲波清洗器；德國賽多利斯公司的BP211D型天平(d = 0.01 mg)；天津市泰斯特儀器有限公司的98-1-B 型電子控溫電熱套。

1.2 實驗材料

1.2.1 試劑 實驗中高效液相色譜儀使用的是美國Fishers 公司生產的色譜級甲醇、乙腈和甲酸，水為超純水；除此之外實驗用到的試劑為分析純。

1.2.2 試藥 杜鵑素（批號：201605）為中國藥品生物制品檢定所生產。

1.2.3 飲片來源 滿山紅藥材購于黑龍江五林、黑龍江林口、吉林通化，每個產地5 批藥材，分別是五林01 ～05、林口01 ～05、通化01 ～05，共15批，編號分別是S1 ～S15。由中國科學院長春應用化學研究所質譜中心皮子鳳副研究員鑒定為興安杜鵑Rhododendron dauricum L.葉。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

將杜鵑素對照品精密稱量，取適量甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

選用滿山紅葉100 g，采用回流法提取2 回，第1 回加入12 倍水，放置30 min，回流提取30 min，過200 目濾布，濾液備用；藥渣第2 回加入10 倍水，提取20 min，過200 目濾布，合并2 次濾液，減壓濃縮至500 mL，凍干，取凍干粉0.1 g，加入20 mL 水超聲提取（功率100W，頻率40 KHz）60 min，放至室溫，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件的確定

2.3.1 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS Ⅲ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱，用甲醇-0.3%甲酸水溶液為流動相系統梯度洗脫，流速為0.2 mL·min-1，梯度洗脫，檢測波長為297 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 空白溶劑干擾考察 將甲醇作為空白溶劑，按照“2.3.1”項色譜條件，開始檢測。滿山紅葉的指紋圖譜不受空白溶劑影響。見圖1。

圖1 空白溶劑色譜圖

2.3.3 對照品和供試品峰比對 將“2.1”項的對照品溶液和“2.2”項的供試品溶液，按照“2.3.1”項的色譜條件，用高效液相色譜儀檢測。結果顯示所選藥材中含有杜鵑素。對照品色譜圖見圖2，供試品色譜圖見圖3。

圖2 對照品色譜圖

圖3 供試品色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取“2.1”項下的對照品溶液，加適量甲醇制成每1 mL 含100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg 的對照品溶液，照“2.3.1”項的實驗條件，用高效液相色譜儀檢測，峰面積為X 軸，以含量為Y軸，得到杜鵑素的回歸方程為Y=2E+0.9X-492 161，r = 0.999 5，線性范圍3.125 ～100 μg，表明線性良好。

2.4.2 精密度試驗 選用適量的“2.2”項供試品溶液，根據“2.3.1”項的實驗條件，連續進樣6 次，10 個共有峰相對保留時間RSD ＜1%，相對峰面積的RSD ＜3%，供實驗用儀器具有良好的精密度，結果見表2，表3。

2.4.3 穩定性試驗 選用適量的“2.2”項供試品溶液，根據“2.3.1”項確定的色譜條件，在0、2、5、8、14、18、24 h 依次測定，10 個共有峰的相對保留時間RSD ＜2%，相對峰面積RSD ＜3%，證明該溶液24 h 內化學成分穩定，結果見表4，表5。2.4.4 重復性試驗 根據“2.2”項確定的供試品制作方式制作6 份，分別根據“2.3.1”項確定的色譜條件檢測，分析說明10 個共有峰的相對保留時間RSD ＜1%，相對峰面積的RSD ＜3%，具備良好的重復性，結果見表6，表7。

2.5 滿山紅葉中杜鵑素含量測定

用“2.2”下方法，制備15 批滿山紅葉的供試品溶液；取“2.1”下對照品適量，用適量甲醇稀釋成每1 mL 含0.05 mg 的對照品溶液，按照“2.3.1”項的色譜條件，分別用高效液相色譜儀檢測，結果見表8。

表2 滿山紅葉精密度試驗的相對保留時間結果

表3 滿山紅葉精密度試驗的相對峰面積結果

表4 滿山紅葉穩定性試驗的相對保留時間結果

表5 滿山紅葉穩定性試驗的相對峰面積結果

表6 滿山紅葉重復性試驗的相對保留時間結果

表7 滿山紅葉重復性試驗的相對峰面積結果

2.6 指紋圖譜建立及分析

2.6.1 指紋圖譜的建立 取“2.1”項的對照品溶液和“2.2”項下供試品溶液，按“2.3.1”項的色譜條件，使用高效液相色譜儀檢測。所得滿山紅葉HPLC 對照圖譜見圖4，15 批滿山紅葉色譜疊加圖見圖5。

圖4 所示，該指紋圖譜找到10 個共有峰，通過與對照品色譜圖對比，確認10 號峰為杜鵑素，并將9 號峰作為參照S 峰。

2.6.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件”（2012 版），采用中位數法依次進行15 批滿山紅葉指紋圖譜的相似度評價，結果見表9。根據表9 能夠得出，15 批滿山紅葉紋圖譜整體相似度在0.986 ～0.999，均＞0.9，具有較高的一致性。

圖4 滿山紅葉與對照品溶液指紋圖譜對比圖

圖5 15 批滿山葉HPLC 圖譜

表8 滿山紅葉中杜鵑素含量測定結果

表9 15 批滿山紅葉指紋圖譜的相似度結果

2.6.3 聚類分析 將15 批滿山紅葉的10 個共有峰峰面積導入SPSS 20.0，運用平均歐式距離法，進行聚類分析，見圖6。分類結果表明不同產地滿山紅藥材在分類距離上較遠，即使同一產地其分類距離也存在明顯差異性。初步分析，可能與滿山紅藥材采摘時間、貯存方式、氣候等有關。15 批滿山紅葉在產地和批次上其主化學成分種類具有代表性，指紋圖譜能夠反映出樣品的全貌。

圖6 滿山紅葉聚類分析圖

3 討論

本實驗供試品的制作方法，考察了不同提取溶劑和提取方式對滿山紅葉指紋圖譜的影響。在提取溶劑方面，選取了水、60%甲醇、稀乙醇三種溶劑作為提取溶劑，結果發現，滿山紅凍干粉在三種溶劑中的溶解度都很好，但是以水作提取溶劑的色譜圖無論在出峰數目還是分離度上均優于其他兩種溶劑的色譜圖，因此選擇水作為提取溶劑。在提取方式方面，選擇了超聲提取法和回流提取法，結果發現，2 種方法提取的滿山紅葉色譜圖差別很小，但是超聲提取方法更加簡便，因此選擇超聲的方法作為提取方法。

本實驗對于色譜條件的確定，考察了色譜柱、檢測波長、流動相系統，流速、柱溫對滿山紅葉指紋圖譜的影響。在色譜柱方面，選了Shim-Pack XR-ODSⅢ（2.0 mmi.d×150 mm）、Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，結果表明樣品 在Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm） 和YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）中不能達到分離要求，而在Shim-Pack XRODSⅢ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱中不僅出峰快、數目多而且分離度符合要求，所以選擇Shim-Pack XR-ODSⅢ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱作為該實驗色譜柱。在檢測波長方面，用二極管陣列檢測器檢（DAD）中200 ～400 nm 依次掃描對照品溶液和供試品溶液，結果顯示在檢測波長297 nm 處2個樣品均有最大吸收，色譜圖信息豐富，杜鵑素峰高較高，所以選用297 nm 為檢測波長。在流動相系統方面，選取不同種類有機相（甲醇、乙腈）和不同成分水相（0.3%甲酸水溶液、0.3%醋酸水溶液）構成的流動相系統對供試品溶液色譜峰分離的影響，篩選乙腈-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3% 醋酸水溶液等流動相系統，結果顯示，乙腈-0.3% 甲酸水溶液流動相系統不利于樣品的分離，出峰數目稀少且分離度不好，甲醇-0.3% 甲酸水溶液和甲醇-0.3%醋酸水溶液流動相系統對樣品分離差別不明顯，但是甲醇-0.3%甲酸水溶液流動相系統色譜圖信息更豐富，分離度更好，故確定該流動相系統作為該實驗檢測的流動相。在流速方面，選擇了0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.25 mL·min-1進行篩選。結果表明，用0.1 mL·min-1流速檢測色譜峰出峰不完全，用0.25 mL·min-1流速檢測色譜峰分離度不好，用0.2 mL·min-1流速檢測色譜峰出峰數目完全，分離度較好，故確定流速為0.2 mL·min-1。在柱溫方面，對25 ℃、30 ℃、35 ℃柱溫進行篩選。結果表明升高柱溫，分離效果變差，因此確定了25 ℃作為檢測柱溫。

15 批滿山紅葉的指紋圖譜整體相似度范圍0.986 ～ 0.999，均＞0.9，相似度良好，15 批滿山紅葉中杜鵑素含量RSD 為0.11%，表明其含量沒有明顯差異，但是聚類分析結果將15 批滿山紅葉分為四類，且10 個共有峰峰面積的RSD 范圍6%～30%，說明杜鵑素的含量對其整體含量變化影響很小，其他化學成分含量變化起主要作用，初步分析應該與滿山紅中草藥產地、生長環境、采摘時間、放置條件和放置時間等有關。

本研究運用高相液相色譜分析法，建立了滿山紅葉的指紋圖譜，該指紋圖譜可以全面展現滿山紅葉化學成分的特點，適用于因產地、批次、生長環境等因素的不同，出現的質量不均一的滿山紅葉。該方法簡便易行，指紋峰分離度好，具有較高的可信度，為后續滿山紅葉的研究開發提供科學依據。