神經節苷脂預處理對布比卡因誘導N2a細胞焦亡的影響及其機制

劉丹，劉敬臣

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西南寧530021

布比卡因是一種經典的酰胺類局麻藥，具有起效快、術后鎮痛作用強等特點，常被應用于局部阻滯麻醉中。研究［1］發現，布比卡因具有潛在的神經毒性作用，會誘發神經細胞的毒性損傷，從而引起多種神經功能并發癥。神經節苷脂（GM-1）廣泛存在于哺乳類動物細胞膜中，尤其在神經細胞膜中含量豐富，具有中和神經毒性物質對膜的毒性、清除自由基的功能，因而有保護神經細胞、促進神經元細胞軸突生長和突觸形成的作用［2］。體內外模型研究［3-4］發現，GM-1能有效抑制神經細胞凋亡，改善神經功能，證實GM-1 對急性脊髓損傷、神經細胞毒性具有一定的神經保護及治療作用。目前關于布比卡因在細胞程序性死亡方面的文獻報道廣泛，大部分都集中于凋亡機制方面［5］，但是細胞凋亡并不能完全解釋局麻藥神經毒性及其伴隨的炎癥反應，而有關布比卡因誘導神經元細胞是否發生焦亡，以及GM-1 預處理能否通過調節焦亡通路減輕布比卡因對N2a細胞損傷，目前相關研究甚少。2019年12月—2020年10 月，本研究觀察了GM-1 預處理對布比卡因誘導N2a細胞焦亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 N2a 細胞購自中國科學院上海細胞庫，布比卡因粉末購自美國Sigma 公司，GM-1溶液購自捷特公司，MEM 培養基、澳洲胎牛血清購自美國Gibco 公司，CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司，GSDMD抗體購自美國Santa Cruz公司，NLRP3抗體、Caspase-1 抗體購自美國 Noves 公司，GAPDH 抗體購自美國CST 公司，TUNEL 試劑盒購自美侖公司，Caspase-1 活性檢測試劑盒購自索萊寶公司，乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 GM-1 預處理及細胞分組 N2a 細胞用10%胎牛血清加1%雙抗的MEM 培養基中，于37 ℃、5% CO2清潔培養箱中培養，每2 天更換一次新鮮培養液。待細胞生長密度達85%以上，用0.25%胰酶進行消化、傳代后，接種于新培養瓶中進行后續相關實驗。取對數生長期N2a細胞隨機分為3組：布比卡因組（B 組）加入終濃度為900 μmol/L的布比卡因培養24 h，GM-1預處理組（G+B組）加入5 μmol/L GM-1預處理24 h后再加入900 μmol/L的布比卡因繼續培養24 h，對照組（C組）不加入GM-1或布比卡因。

1.3 各組細胞形態觀察 ①取各組細胞接種于6孔板，每孔隨機選擇3 個以上的視野，用200 倍倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態。②取各組細胞接種于 6 孔板，3% 戊二醛固 2 h，PBS 浸泡清洗 3 次，每次10 min，四氧化鋨固定 1 h，PBS 浸泡清洗 3 次，每次10 min，梯度乙醇浸泡脫水，放入真空干燥器中抽真空干燥，IB3 離子濺射儀噴鍍后放入掃描電鏡觀察各組細胞形態。

1.4 各組細胞活力測算 采用CCK-8 法。取各組細胞，以3×104/mL接種于96孔培養板，每孔加100 μL細胞懸液，在37 ℃、5% CO2條件細胞培養箱下培養24 h，加入 10 μL CCK-8 試劑，恒溫培養箱避光孵育1 h 后，以空白孔為空白組，使用酶標儀于450 nm 處測定其吸光度值，計算細胞存活率，以細胞存活率表示細胞活力。細胞存活率（%）=（各組吸光度值?空白組吸光度值）/（對照組吸光度值?空白組吸光度值）×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.5 各組細胞凋亡率測算 采用TUNEL 染色試驗。取各組細胞接種于12 孔板，藥物作用24 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3 次，以0.3%Triton X-100 室溫通透 5 min，按照 TUNEL 試劑盒說明書進行操作，37 ℃條件下與TUNEL反應混合液避光孵育1 h，PBS 潤洗3 次，用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并計數TUNEL 染色陽性細胞數及細胞總數，計算TUNEL染色陽性細胞率，以TU?NEL 染色陽性細胞率表示細胞凋亡率。TUNEL 染色陽性細胞率（%）=TUNEL 染色陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.6 各組細胞中LDH 含量測算 采用LDH 釋放實驗。LDH 含量能夠有效地反映細胞膜的完整性與否，可用于定量檢測細胞毒性，常用來評估細胞受損程度。取各組細胞，PBS 清洗2遍，加入100 μL 的裂解液置于冰上裂解10 min，2 500 r/min 離心10 min后取上清，按照LDH 測定試劑盒說明書操作步驟，使用酶標儀于490 nm 處檢測各組吸光度值，計算各組細胞中LDH 含量。細胞中LDH 含量（U/L）=（各組吸光度值?對照組吸光度值）/（標準管吸光度值?空白管吸光度值）×標準品濃度（2 mmol/L）。實驗重復3次，取平均值。

1.7 各組細胞中天冬氨酰特異性半胱氨酰蛋白酶1（Caspase-1）活性測算 采用Caspase-1 活性實驗。取各組細胞，經胰酶消化收集后，1 500 r/min 離心5 min，加入裂解液重懸細胞沉淀，冰浴裂解15 min，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，取細胞上清液用Bradford法進行蛋白定量。在96孔板中將反應緩沖液 60 μL、細胞裂解上清液 50 μL 和 Caspase-1 底物5 μL混合，37 ℃孵育2 h，應用酶標儀讀取405 nm處的吸光度值，在相同條件下獲得標準曲線，以對照組細胞Caspase-1 活性作為100%，根據標準曲線計算各組細胞中Caspase-1活性。

1.8 各組細胞焦亡相關蛋白細胞炎癥小體活化蛋白質-gasdermin D（GSDMD）、NOD 樣受體蛋白3（NL?RP3）和Caspase-1 蛋白檢測 采用Western blotting法。取對數生長期N2a 細胞，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，超聲裂解，4 ℃條件下12 000 r/min 離心，吸取上清，加入蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸變性后分裝?80 ℃備用，BCA 法進行蛋白定量。每組取20 μg 蛋白在10%SDS-PAGE 膠上電泳，后轉移至 PVDF 膜，用 5%BSA加入 GSDMD、NLRP3 和 Caspase-1 抗體（稀釋比1∶1 000），孵育，4 ℃搖床過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗體IgG（1∶3 000），室溫搖床孵育60 min，洗膜后加入化學發光試劑，應用膠片曝光顯影后掃描分析，用Image J 軟件測定灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態變化 ①倒置相差顯微鏡下，C組細胞胞體形態多樣且飽滿、形態規則、周圍有光暈、網狀分布；B 組細胞皺縮變圓，突觸明顯變短甚至消失，細胞膜通透性增高、破裂；G+B組細胞生長狀態良好，胞漿豐富，細胞間排列密集，交織成網狀。②掃描電鏡下，C 組細胞呈圓形，細胞膜完整且光滑；B 組細胞形態異常，胞體明顯腫脹，細胞間緊密連接結構消失，細胞突觸折斷、消失，失去了細胞膜的完整性，其胞膜上形成了大小不等的微孔，產生凋亡小體樣的細胞突起囊泡；G+B組細胞損傷形態明顯減輕，數量也更多，未見細胞膜的完整性喪失及微孔形成，細胞間聯系緊密。詳見圖1。

圖1 各組細胞形態變化

2.2 各組細胞活力比較 C、B、G + B 組細胞活力分 別 為 100.00%、51.24% ± 3.71%、68.36% ±1.83%，組間相比，P均＜0.05。

2.3 各組細胞凋亡率比較 C、B、G + B 組細胞凋亡率分別為 2.54% ± 0.46%、74.36% ± 2.35%、58.63%±4.62%，組間相比，P均＜0.05。

2.4 各組細胞中LDH 含量比較 C、B、G + B 組細胞中 LDH 含量分別為（75.36 ± 9.28）、（583.56 ±10.39）、（274.07 ± 6.54）U/L，組間相比，P均＜0.05。

2.5 各組細胞中Caspase-1 活性比較 C、B、G + B組細胞中Caspase-1活性分別為100%、436%±104%、258% ±46%，組間相比，P均＜0.05。

2.6 各組細胞中 GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白相對表達量比較 各組細胞中GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白相對表達量比較見表1。由表1 可知，與 C 組相比，B 組細胞中 GSDMD、NLRP3、Cas?pase-1 蛋白相對表達量均升高（P均＜0.05）；與B 組相比，G + B 組細胞中 GSDMD、NLRP3、Caspase-1 蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05）。

表1 各組細胞中GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達量比較（>）

表1 各組細胞中GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達量比較（>）

注：與C組相比，*P＜0.05；與B組相比，#P＜0.05。

組別C組B組G+B組caspase-1蛋白1.19±0.24 3.84±0.36*2.25±0.65*#GSDMD蛋白1.07±0.16 3.14±0.35*2.07±0.04*#NLPR3蛋白0.95±0.03 4.16±0.29*2.63±0.62*#

3 討論

近年來，局麻藥神經毒性機制及防治一直是研究熱點所在，N2a 細胞經一定濃度布比卡因誘導的神經細胞損傷已被廣泛用于神經毒性的體外模型［6］。我們前期通過細胞層面研究［7］發現，GM-1 預處理顯著降低布比卡因誘導N2a 細胞的Caspase-3蛋白表達，抑制布比卡因產生的神經毒性，從而發揮神經保護作用。近年來，GM-1及其神經保護作用受到越來越多的關注。眾多研究［8］表明，GM-1 通過影響神經系統的發育、促進神經細胞軸突的生長與再生發揮神經保護作用。本研究主要在體外模型、分子層面上探究GM-1 對布比卡因產生的神經細胞焦亡的影響，并對其機制進行進一步探討。

研究［9］表明，細胞程序性死亡既可出現在正常生理情況下，也出現在機體受到刺激或損傷時的非正常生理狀態中，其主要方式有凋亡、自噬及焦亡3種死亡方式，在細胞生命各項活動中發揮重要的作用。細胞焦亡是近年來提出的程序性細胞死亡形式，兼有壞死與凋亡的形態學特征，表現為細胞核濃縮和染色質DNA 斷裂，細胞膜形成孔洞并且胞膜破裂，胞質內容物釋放并引起強烈的炎癥反應［10］。最新研究［11］發現，細胞焦亡是由 GSDMD 介導調控的一種新型程序性細胞死亡形式，為細胞死亡補充了新的概念，可分為依賴Caspase-1 的經典途徑及Cas?pase-4、5、11 的非經典途徑。Caspase-1 是細胞焦亡過程中已明確激活的經典因子。內外源性刺激因素通過不同途徑激活炎性小體從而活化Caspase-1，造成細胞膜穿孔，增加膜的通透性，使得細胞內容物從孔道漏出以及IL-1β、IL-18等促炎因子成熟和釋放，進而引發一系列強烈的炎癥反應［12］。NLRP3 是一種被廣泛研究的炎癥小體，屬于細胞質內模式識別受體，可被多種不同的信號系統參與激活，通過與ASC結合募集Caspase-1前體并產生活性的Caspase-1，一方面說明了焦亡的出現，另一方面也提示了炎癥反應的發生［13］。目前有研究［14］發現，細胞焦亡主要依靠炎癥小體激活Caspase 家族部分蛋白，使其激活、切割GSDMD 蛋白，活化的GSDMD 蛋白轉位至細胞膜，形成膜孔，胞質外流，最終導致細胞滿破裂、死亡。因此，本研究檢測通過GSDMD 蛋白、NLRP3 為代表的炎癥小體以及Caspase-1 為代表的Caspase 家族等作為焦亡發生的指標。

本研究中結果顯示，布比卡因處理N2a細胞24 h明顯降低細胞存活率，從形態學角度觀察TUNEL染色陽性細胞率顯著增加，掃描電鏡中發現布比卡因處理N2a 細胞產生焦亡小體，細胞膜形成大小不等的孔道，細胞通透性增高，細胞內容物LDH 等釋放到細胞外增多，以及GSDMD、NLRP3 和Caspase-1蛋白的產生進一步確認焦亡的發生，證實了其對N2a 細胞的神經毒性作用，從分子層面分析活化Caspase-1 含量增加，焦亡相關蛋白GSDMD、NLRP3和Caspase-1蛋白相對表達量均明顯上調，這些結果提示布比卡因誘導N2a細胞發生焦亡。

本研究發現，GM-1可能通過作用于細胞膜上的受體，抑制布比卡因誘導的焦亡的作用，減少LDH的釋放，從而減輕細胞損傷。在本實驗中，GM-1 對N2a 細胞預處理24 h，顯著降低TUNEL 染色陽性細胞率，明顯減少LDH的釋放以及活化的Caspase-1的產生，可部分逆轉布比卡因誘導N2a 細胞損傷形態變化，減少焦亡小孔的形成，從而降低細胞焦亡的發生，有效抑制 GSDMD、NLRP3 和 Caspase-1 蛋白的表達來減少N2a細胞的死亡，從而減輕細胞損傷，降低布比卡因的神經毒性作用，抑制細胞焦亡的進展過程，提示可能與其神經保護作用有關。

本研究還存在一定的局限性。首先，雖然發現了布比卡因可誘導N2a 細胞焦亡相關蛋白的表達，但未能在組織層面提供更進一步的證據。其次，布比卡因誘導N2a細胞損傷可能存在多種機制共同參與調控，不同的死亡模式之間并非完全孤立，在某種情況下極有可能向另一種完成轉化，本研究沒有進一步的深入，有待未來研究繼續探討。

綜上所述，本研究深入細胞水平證實GM-1 抑制N2a 細胞發生細胞焦亡的分子機制，減輕布比卡因引起的神經毒性，改善減輕神經細胞焦亡和炎性病變，其機制可能與激活GSDMD-NLRP3-Caspase-1信號途徑有關。本研究不僅為GM-1 在臨床神經保護作用方面的應用提供更加有利的理論依據，也為局麻藥神經毒性研究在細胞死亡機制中尋求更多可能的治療靶點提供新思路。