高良姜精油和純露的體外抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性研究

劉夢潔，林麗靜，姜永超

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070；2.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，廣東湛江524002；3.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東湛江524002）

高良姜，通常指姜科（Zingiberaeeae）山姜屬（Alpinia Roxb.）多年生草本植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的根莖。我國廣東、廣西、云南、海南等地是高良姜的主要產地，其中以廣東徐聞縣所產高良姜的道地性最強[1]。在我國，高良姜屬于“藥食同源”的品種[2]，在臨床上常用于治療消化不良、胃寒嘔吐等消化道系統疾病[3]；在食品中則被大量用作調味料等[4]。高良姜的主要化學成分包括黃酮類、揮發油、二芳基庚烷類、苯丙素類、糖苷類等[5-6]，這些化學成分對于高良姜具備的生物活性起著非常重要的作用[7]。

植物精油（essential oil）是指經過一定方式萃取、植物所特有的有機化合物。植物精油屬于次生代謝產物，室溫下為具有揮發性的、小分子的油狀液體，主要來源于植物的各器官[8]。純露（hydrosol）是芳香植物精油在水中以最高濃度溶解量存在的精華[9-10]。通過一定方法獲取的高良姜精油和純露，在食品、日用化學品、醫藥等領域中具有廣闊的應用前景。

本文主要研究超臨界法輔助提取的高良姜精油和純露的體外抗氧化活性，以及高良姜精油的酪氨酸酶抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高良姜：采自廣東徐聞縣；2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海源葉生物有限公司；過硫酸鉀（K2S2O8）：國藥集團化學試劑有限公司；羥自由基清除能力檢測試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸酶（≥500U/mg）、L-酪氨酸、熊果苷：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇：西隴科學股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

萬能粉碎機（DFT-200）：上海鼎廣機械設備有限公司；數顯恒溫水浴鍋（SB-2000）：上海愛郎儀器有限公司；電爐（SH1983）：江蘇東臺市正華電爐廠；pH 計（FE20-FiveEasy PlusTM）：美國Mettler Toledo 公司；紫外-可見分光光度計（UV-1780）：日本Shimadzu 公司。

1.3 方法

1.3.1 高良姜精油和純露的制備

樣品的超臨界提取參照林麗靜等[11]方法。將高良姜原料除雜、洗凈、粉碎。稱取1 kg 粉碎后的高良姜裝入超臨界CO2萃取裝置的物料釜，密封后連接裝置管路，取400 mL 純凈水加至純露萃取容器內，在萃取溫度40 ℃、萃取壓力14 MPa 條件下萃取2 h～3 h，得到超臨界輔助提取法制備的高良姜精油和純露。

樣品的水蒸氣提取參照袁源等[12]方法。稱取一定量的高良姜，按料液比1 ∶8（g/mL）～1 ∶10（g/mL）浸水蒸餾，每隔2 h 停止加熱20 min，共蒸餾6 h，得到水蒸氣蒸餾高良姜精油和純露。

1.3.2 總抗氧化能力的測定

采用總抗氧化能力檢測試劑盒測定樣品的總抗氧化能力。將FeSO4標準溶液稀釋至梯度濃度，按標準溶液與試劑二1 ∶1 的體積比充分混勻后反應10 min，去離子水調零，測定波長593 nm 處吸光度值（蒸餾水作空白），計算ΔA=A標準-A空白。以Fe2+終濃度（0.000 78、0.001 56、0.003 125、0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 μmol/mL）為橫坐標，以ΔA 為縱坐標繪制標準曲線Y=16.742X+0.044。

取超臨界輔助提取法和水蒸氣蒸餾法所得高良姜精油和純露樣品，按試劑盒說明書操作。充分混勻反應10 min，以去離子水調零，取200 μL 反應液于微量玻璃比色皿，分別測定593 nm 處的吸光度值。對照管只測一次，各吸光度值取3 次平行的平均值。計算ΔA′=A測定-A對照。

總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）計算如式（1）。

式中：X 為測定樣品的ΔA′帶入標準曲線方程求得的標準離子濃度，μmol/mL；V反總為反應總體積，1.02 mL；V樣為反應中樣品體積，0.03 mL；T-AOC為每毫升樣品抗氧化能力達到同樣吸光度變化值（ΔA）所需的標準離子（Fe2+）濃度，μmol/mL。

1.3.3 羥自由基清除能力的測定

采用羥自由基清除能力檢測試劑盒測定樣品的羥自由基清除能力。取超臨界輔助提取法和水蒸氣蒸餾法所得高良姜精油和純露樣品，按表1 操作，在1.5 mL 離心管中加入相應試劑。

表1 測定操作標準Table 1 Measurement operation μL

其中管中加入試劑一、二、三后需先混勻，防止顏色不均一，然后再依次加入樣品、試劑四和去離子水，混勻后37℃孵育60 min。10 000 r/min 常溫（25 ℃）離心10 min，取200 μL 上清液于微量玻璃比色皿分別測定536 nm 處的吸光度值。空白管、對照管和測定管吸光度值分別記為A空、A對和A測。對照管和空白管只測一次測定管各吸光度值取3 次平行的平均值。

羥自由基清除率計算如式（2）。

1.3.4 ABTS+自由基清除能力的測定

精確稱取0.038 4 g ABTS 試劑溶于10 mL 蒸餾水，精確稱取0.006 6 g 過硫酸鉀溶于10 mL 蒸餾水，將ABTS 溶液（7.00 mmol/L）與硫酸二氫銨溶液（2.45 mmol/L）按體積比1∶1 混合，室溫（25 ℃）下避光反應12 h～16 h，得到ABTS+自由基儲備液，于4 ℃避光保存備用。將一定體積的ABTS+自由基儲備液用無水乙醇稀釋40 倍～50 倍，使稀釋液在波長734 nm 處吸光度值為0.7±0.02（無水乙醇調零），此時得到ABTS+·工作液。

準確稱取0.125 0 g 高良姜精油，用無水乙醇定容至100 mL，得到1.25 mg/mL 高良姜精油的乙醇溶液，并逐步稀釋分別得到0.625、0.362 5、0.181 3、0.090 6、0.045 3 mg/mL 的樣品稀釋液。超臨界輔助提取法所得高良姜純露分別用無水乙醇稀釋得到10、20、30、40、50 mL/100 mL 稀釋液。按表2 配制反應混合液于15 mL 離心管，充分搖勻后室溫（25 ℃）下避光反應30 min，以無水乙醇調零，測定各混合液在734 nm 波長處的吸光度值。每組設置3 個平行試驗。

表2 反應混合液配制比例Table 2 Proportion of reaction mixture mL

ABTS+自由基清除率計算如式（3）。

式中：A0、A1、A2分別為ABTS+自由基清除能力測定反應中配制的對照管、測定管、空白管反應液在517 nm 波長處測得的吸光度值。

以樣品液濃度（mg/mL）為橫坐標，自由基清除率為縱坐標作標準曲線，計算IC50（ABTS+自由基清除率為50%時所需的樣品質量濃度）。

1.3.5 DPPH 自由基清除能力的測定

配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，0.625、0.362 5、0.181 3、0.090 6、0.045 3、0.022 7 mg/mL 的高良姜精油稀釋液，以及20、40、60、80 mL/100 mL 的高良姜純露稀釋液。按表3 配制反應混合液，置于15 mL 離心管。

表3 反應混合液配制比例Table 3 Proportion of reaction mixture mL

混合液充分搖勻后室溫（25 ℃）下避光反應30 min，以去離子水調零，測定各混合液在517 nm 波長處的吸光度值。每組設置3 個平行試驗。

DPPH 自由基清除率計算如式（4）。

式中：A0、A1、A2分別為DPPH 自由基清除能力測定反應中配制的對照管、測定管、空白管反應液在517 nm 波長處測得的吸光度值。

以樣品液濃度（mg/mL）為橫坐標，自由基清除率為縱坐標作標準曲線，計算IC50（DPPH 自由基清除率為50%時所需的樣品質量濃度）。

1.3.6 酪氨酸酶抑制活性測定

參照孫玉潔[13]的方法并稍作修改。配制pH 6.8 磷酸緩沖液，于4℃保存備用。準確稱取0.135 9 g L-酪氨酸于燒杯中，滴入5 滴～10 滴濃鹽酸，加水約30 mL，在電爐上緩慢加熱溶解，然后滴加氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，用去離子水定容至100 mL，制成7.5 mmol/L L-酪氨酸溶液。準確稱取高良姜精油和純露各0.1000 g，分別溶于20 mL 二甲基亞砜，得到5 mg/mL 樣品溶液，然后逐步稀釋得到2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL 樣品溶液；按同樣方法得到5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL熊果苷溶液。稱取0.010 0 g 酪氨酸酶干粉（-20 ℃），溶于50 mL 去離子水，制成100 U/mL 酶液，于4 ℃保存，并在4 h 內使用。按表4 配制反應體系，以熊果苷作為陽性對照。

在反應體系中，待測液（包括樣品與陽性對照熊果苷）的實際反應濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL。依次向10 mL 離心管中加入磷酸鈉緩沖液、不同濃度梯度的待測液和酶液，30 ℃水浴10 min；然后繼續在水浴條件下加入反應底物L-酪氨酸，并立即開始計時，反應20 min 時停止水浴，測定475 nm 處吸光度值。其中，測定吸光度值時，試驗組用含相應種類和濃度待測液的陰性對照組1 調零，標準對照組用陰性對照組2 調零。試驗組各濃度均進行3次平行試驗。

用下列公式計算待測液對酪氨酸酶抑制活性的抑制率，并依據酶抑制率-濃度曲線擬合方程估算半數抑制濃度（IC50）。

式中：A、B 分別為標準對照組和試驗組測得的吸光度值。

1.4 數據處理

數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 超臨界輔助提取高良姜精油和純露的體外抗氧化活性

2.1.1 總抗氧化能力

與水蒸氣蒸餾法提取的高良姜精油和純露相比較，超臨界法輔助提取高良姜精油和純露的總抗氧化能力如圖1 所示。

圖1 各樣品的總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of different samples

由圖1 可知，試驗中各樣品的總抗氧化能力依次為：超臨界輔助提取高良姜精油＞水蒸氣蒸餾高良姜精油＞超臨界輔助提取純露＞水蒸氣蒸餾高良姜純露。其中，超臨界輔助提取的高良姜精油的總抗氧化能力明顯強于其它樣品。

2.1.2 羥自由基清除能力

超臨界輔助提取法及水蒸氣蒸餾法提取高良姜精油和純露的羥自由基清除能力如表5 所示。

表5 各樣品的羥自由基清除能力Table 5 Hydroxyl radical scavenging ability of different samples

由表5 可知，高良姜精油的羥自由基清除能力要強于相同方法條件下提取的高良姜露的羥自由基清除能力；就制備方法而言，以超臨界輔助法制備高良姜精油、純露對羥自由基的清除能力稍遜于水蒸氣蒸餾法。

按照公式（2）確定的超臨界輔助提取和水蒸氣蒸餾高良姜純露的羥自由基清除率表現為計算上的負值。出現這一現象的原因，可能是樣品對羥自由基反應體系的抑制微弱，同時在抑制反應過程中羥自由基與樣品中某些化學成分反應產生了其它顏色物質，致使在測定波長處的吸光度甚至低于對照管吸光度。

2.1.3 ABTS+自由基清除能力

超臨界輔助提取高良姜精油和純露的ABTS+自由基清除能力如圖2 所示。

圖2 高良姜精油和純露的ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+·scavenging ability of essential oil and hydrolate from Alpina officinarum Hance

由圖2 可知，隨樣品濃度的增加，各樣品對ABTS+自由基的清除能力逐漸增大。其中，超臨界輔助提取高良姜精油對ABTS+自由基清除率的增加程度隨濃度增加而逐漸減緩，清除率趨于穩定，超臨界輔助提取高良姜精油對ABTS+自由基清除率的半數清除濃度IC50約為0.141 mg/mL；水蒸氣蒸餾法所得高良姜精油的IC50約為6.509 mg/mL。超臨界輔助提取高良姜純露對ABTS+自由基清除的IC50約為31 mL/100 mL（試驗純露原液31 mL 稀釋至100 mL）；水蒸氣蒸餾高良姜純露不經稀釋時（即純露原液）的ABTS+自由基清除率不足50%，僅約43.3%。由上述結果可知，超臨界輔助提取高良姜精油/純露的ABTS+自由基清除能力分別強于水蒸氣蒸餾高良姜精油/純露。

2.1.4 DPPH 自由基清除能力

超臨界輔助提取高良姜精油和純露的DPPH 自由基清除能力如圖3 所示。

圖3 高良姜精油和純露的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH·scavenging ability of essential oil and hydrolate from Alpina officinarum Hance

隨樣品濃度的增加，各精油樣品對DPPH 自由基的清除能力趨于穩定，各純露樣品對DPPH 自由基的清除能力逐漸增大，與對ABTS+自由基清除能力的變化趨勢相似。其中，超臨界輔助提取高良姜精油對DPPH 自由基清除的IC50約為0.088 mg/mL；水蒸氣蒸餾法所得高良姜精油的反應濃度為0.625 mg/mL（＞0.088 mg/mL）時對DPPH 自由基清除率僅為1.1%，反應濃度增大到10mg/mL 時清除率僅為13.2%（＜50%）。超臨界輔助提取高良姜純露對DPPH 自由基清除的IC50約為74 mL/100 mL，水蒸氣蒸餾高良姜純露原液的DPPH 自由基清除率不足50%，僅約12.8%。由上述結果可知，超臨界輔助提取高良姜精油和純露，其DPPH 自由基清除能力均顯著強于水蒸氣蒸餾所得的對應樣品。

2.2 超臨界輔助提取高良姜精油的酪氨酸酶抑制活性超臨界輔助提取高良姜精油以及陽性對照物熊

果苷的酪氨酸酶抑制能力如圖4 所示。

圖4 超臨界輔助提取高良姜精油的L-酪氨酸酶抑制能力Fig.4 Inhibition of L-tyrosinase in essential oil from Alpina officinarum Hance extracted by supercritical fluid

在試驗范圍內，隨反應體系中高良姜精油濃度的增加，其對L-酪氨酸酶的抑制強度先增大后又減小。在濃度為0.125 mg/mL 時，高良姜精油對體系中L-酪氨酸酶抑制率最高，約為64.0%，明顯高于陽性對照熊果苷對酪氨酸酶的抑制率；在濃度0.5 mg/mL 時，對體系中L-酪氨酸酶抑制率則約為30.0%。

3 結論與討論

本試驗結果顯示，以超臨界流體法輔助提取的高良姜精油和純露，在相同條件下具有比水蒸氣蒸餾法所得相應精油或純露更強的綜合抗氧化活性，總抗氧化能力值更大，對ABTS+自由基以及DPPH 自由基的清除率更高。超臨界輔助提取法提取的高良姜精油對酪氨酸酶的抑制率隨反應濃度增加呈現先增后減的變化。在超臨界流體輔助提取法提取高良姜精油和純露的過程中，萃取溫度低于水蒸氣蒸餾法，操作條件較溫和[14-15]，從而減少提取產物中一部分化學成分由于高溫導致的損失[16]，這可能是超臨界輔助提取法所得樣品體外抗氧化活性更好的原因。通過本文研究，結合對超臨界輔助提取高良姜精油和純露樣品的成分分析，有望為高良姜精油和純露的應用研究及超臨界流體萃取精油和純露的方法推廣提供理論支持。