超高溫巴氏殺菌對全蛋液功能性質和理化性質的影響

馬靜，宋雨齊，馬帥，代偉長，王玉華

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

液蛋產品是將新鮮雞蛋去殼，經加工處理包裝后的蛋制品總稱[1]。市場上大多是經過巴氏殺菌的液蛋產品，分為全蛋液、蛋白液和蛋黃液[2]。目前，歐美等國家的液蛋產品已經十分普及，液蛋制品加工量約占其鮮蛋總量的30%～40%[3]，而我國的液蛋產品生產剛剛起步，未來具有非常廣闊的發展前景[4]。但是目前限制液蛋發展的關鍵因素是其貨架期短，運輸范圍受限，難以得到更好的應用。

在液蛋產品生產過程中，要經過洗蛋、打蛋去殼、蛋液混合及過濾等工藝，都可能受到微生物污染，其中主要包括大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌等[5]，如何減少蛋液中微生物的存在是液蛋應用及食品安全的重中之重，因此殺菌技術是全蛋液生產的關鍵技術。目前，一些冷殺菌技術例如紫外線、超高壓等也受到廣泛關注，但是由于設備限制以及高額的成本等原因，并沒有在實際生產中應用。目前液蛋實際生產中的主要殺菌技術還是巴氏殺菌技術，但常用的傳統巴氏殺菌（64.5 ℃，3 min）具有一定的局限性，殺菌能力差導致產品保質期短，特別是不能有效地殺滅病原微生物，例如H5N1 禽流感病毒要在加工時超過70 ℃才能被殺死[6]，存在安全隱患問題。熱處理溫度升高和時間延長也會影響蛋液的功能性質（穩定性、起泡性、乳化性）、色澤、風味等。近年來，國外發達國家研究開發了超高溫巴氏殺菌系統，全蛋液處理溫度達74 ℃，可以保留全蛋液自身的功能性質并能避免蛋白質的凝結，已經應用于液蛋產品的實際生產[7]。我國在這方面研究還處于起步階段，與發達國家仍然存在很大差距。雞蛋營養成分豐富，這也是影響微生物滅活的重要因素，而不同蛋雞品種、飼料、環境、飼養模式都會影響雞蛋的營養成分組成。

本文通過比較不同殺菌方式對3 種病原微生物的滅活情況、殺菌全蛋液儲藏過程中全蛋液的理化功能性質變化，對超高溫巴氏殺菌在液蛋制品工業生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 設備

UV-2800 分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；TECAN infinite 酶標儀：上海迪奧生物科技有限公司；HH-4 水浴鍋：蘇州威爾實驗用品有限公司；JRA-35S高速均質乳化機：上海弗魯克機電公司。

1.1.2 材料與試劑

新鮮雞蛋、金龍魚大豆油：市售；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，分析純）：北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB，分析純]、8-苯胺萘磺-1-酸鹽（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，ANS，分析純）：Sigma 公司；BCA 試劑盒：賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 全蛋液無菌制備

新鮮雞蛋清洗后，用75%酒精浸泡消毒，置于無菌環境打蛋，去除系帶，混勻。

1.2.2 超高溫巴氏殺菌對3 種病原微生物的作用效果

取保存于-80 ℃甘油中的大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Salmonella typhimurium）、沙門氏菌（Staphylococcus aureus）菌液200 μL 分別加入到5 mL LB 液體培養基中，在37 ℃，150 r/min 恒溫搖床振蕩培養12 h，連續活化3 代，此時菌液濃度為107CFU/mL左右。將活化后的3 種菌液移取1 mL 加入到9 mL 液態蛋中，混勻，置于不同殺菌條件下處理[對照：未殺菌全蛋液；超高溫巴氏殺菌（ultra pasteurization，UP）：74 ℃，60 s；傳統巴氏殺菌（traditional pasteurization，TP）：64.5 ℃，3 min]，按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌含量，觀察處理前后菌數變化。

1.2.3 超高溫巴氏殺菌對全蛋液功能性質的影響

將混勻后的全蛋液分別采用超高溫巴氏殺菌（74 ℃，60 s）、傳統巴氏殺菌（64.5 ℃，3 min）處理后，在4 ℃條件下儲藏6 周，測定其功能性質的變化。

1.2.3.1 起泡性及泡沫穩定性測定

使用蒸餾水稀釋蛋液至5%，記錄此時液體體積V0，使用高速均質乳化機在25 ℃條件下以10 000 r/min攪打1 min，記錄液體體積V1，靜置30 min 后記錄液體體積V30，體積單位均為mL，參照公式計算起泡性（foaming capacity，FC），泡沫穩定性（foaming stability，FS）[8]。

起泡性（FC）見以下公式。

FC/%=（V1-V0）/V0×100

泡沫穩定性（FS）見以下公式。

FS/%=（V30-V0）/（V1-V0）×100

1.2.3.2 乳化性及乳化穩定性測定

用0.5 mol/L 的NaCl 稀釋全蛋液至0.5%，取稀釋液12 mL 與大豆油8 mL，用高速均質乳化機在25 ℃，10 000 r/min 條件下均質1 min 制備乳化液，均質后從底部吸取乳化液20 μL 加入到6 mL 0.1%SDS 溶液中，以不加樣品的SDS 為空白對照，在500 nm 下測吸光值，以此時吸光值A0表示乳化活性（emulsification，EAI），5 min 后在從底部吸取20 μL 乳化液，測吸光值，記此時吸光值與之差為ΔA[9]，ΔT 為t min 與0 min 的差值。

乳化穩定性用乳化穩定指數（emulsification stability，ESI）表示見公式：

ESI=A0×ΔT/ΔA

1.2.4 超高溫巴氏殺菌處理后對全蛋液理化性質的影響

將混勻后的全蛋液分別采用超高溫巴氏殺菌（74 ℃，60 s）、傳統巴氏殺菌（64.5 ℃，3 min）處理后，在4 ℃條件下儲藏6 周，測定其理化性質的變化。

1.2.4.1 溶解度測定

將全蛋液稀釋適宜倍數，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用BCA 試劑盒分別測定稀釋后全蛋液及上清液中蛋白質含量。

1.2.4.2 巰基測定

用Tris-甘氨酸緩沖液稀釋全蛋液至10 mg/mL，在1 mL 稀釋液中加入10 μL Ellman 試劑（DTNB），在室溫25 ℃下反應15 min 后，放入離心機中10 000 r/min反應10 min，在412 nm 下測定吸光值[10]。

1.2.4.3 表面疏水性分析

采用ANS 熒光探針法測定全蛋液的表面疏水性[11-12]。采用磷酸鹽緩沖液（pH7.2）稀釋全蛋液濃度分別為0.005、0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL 5 個不同的蛋白濃度梯度，取4 mL 稀釋液與20 μL ANS（8 mmol/L）混勻后在激發波長395 nm 和發射波長475 nm 下測熒光值，以蛋白濃度及熒光值做曲線，其初始斜率即為表面疏水性H0。

1.2.4.4 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

將全蛋液稀釋至蛋白濃度2 mg/mL，將4×上樣緩沖液與全蛋液混合并在沸水浴中加熱5 min～6 min，冷卻后，取10 μL 樣品及Maker 上樣。電泳濃縮膠濃度為12%，分離膠濃度5%。電泳儀條件：濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V，電泳完成后，染色液染色40 min～60 min，醇脫色劑脫色15 min，10%乙酸靜置（8 h ～9 h）。

1.2.5 數據統計分析

所得數據均利用SPSS 17.0 分析數據，以p＜0.05為顯著性差異。采用prism7 軟件進行數據分析和圖譜處理。

2 結果與分析

2.1 超高溫巴氏殺菌對全蛋液中3 種病原微生物的作用

禽蛋在運輸儲藏及加工過程中易受病原菌的感染，導致禽蛋變質腐敗，影響品質及食品安全。其中主要感染的微生物有3 種：沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌[5]。超高溫巴氏殺菌與傳統巴氏殺菌對全蛋液中的3 種病原微生物滅活效果見圖1。

圖1 超高溫巴氏殺菌對液體全蛋中3 種致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）的影響Fig.1 Effects of ultra-pasteurization on three pathogenic bacteria（E.coli，S.typhimurium，S.aureus）in liquid whole egg

由圖1 可知，采用傳統巴氏殺菌法處理全蛋液中接種的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，其致死率分別為98.42%、98.64%和99.09%，而超高溫巴氏殺菌處理后致死率均有增加，分別為99.65%、99.98%和99.67%，可見超高溫巴氏殺菌的殺菌效果更明顯，尤其是對沙門氏菌滅活效果更為突出。超高溫巴氏殺菌能夠較為有效地保障全蛋液的安全性。

2.2 超高溫巴氏殺菌對全蛋液儲藏期間功能性質的影響

2.2.1 超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏期間起泡性及泡沫穩定性變化

起泡性及泡沫穩定性是全蛋液重要的功能性質之一，蛋清以其優異的起泡性能，被廣泛應用于蛋糕、曲奇餅、慕斯、甜品殼等烘焙食品，是良好的發泡劑[13]。然而，高溫會引起蛋白質變性、聚集，可能會導致起泡性及泡沫穩定性產生不同程度的變化，本文比較了超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌對全蛋液起泡性及泡沫穩定性的影響，觀察不同處理方式的全蛋液儲藏期間起泡性及泡沫穩定性的變化見圖2。

圖2 全蛋液隨儲藏時間延長起泡性及泡沫穩定性的變化情況Fig.2 Changes in foaming and foaming stability of liquid whole egg with storage time

由圖2 可知，第0 周時超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌全蛋液起泡性與未殺菌全蛋液比較顯著增加，但三者起泡性在儲藏1周后均顯著下降，分別為8.77%，8.58%和10.83%，三者之間沒有顯著差異；隨著儲藏時間的延長，超高溫巴氏殺菌全蛋液，先呈現略微上升，5 周后又呈下降的趨勢，傳統巴氏殺菌蛋液及未殺菌蛋液亦有類似趨勢，但變化均不顯著。隨著儲藏時間的延長，全蛋液溶解度降低，可溶性蛋白含量減少，起泡性降低，同時，全蛋液在儲藏的過程中蛋白質的結構會發生改變，有的甚至解體變性，導致全蛋液中的起泡性能的蛋白減少，許多蛋白發生聚合，從而使全蛋液的起泡性能降低，但是在冷藏的條件下，蛋白質分子間相互作用力受到影響，從而減弱蛋白質聚合作用，使得后期全蛋液起泡性并未出現明顯下降[14]。超高溫巴氏殺菌全蛋液與巴氏殺菌全蛋液相比，在整個儲藏期間起泡性之間無顯著差異性（p＞0.05）；與未殺菌蛋液相比，只在第5、6 周顯示出明顯高于超高溫巴氏殺菌蛋液，這可能與全蛋液在儲藏期間蛋白質復合解離等復雜變化有關。

全蛋液泡沫穩定性在冷藏期間略微上升，但基本不變。而超高溫巴氏殺菌全蛋液除第0 周和第1 周外，與傳統巴氏殺菌和未殺菌蛋液之間相比，無明顯變化。第1 周時，雖與傳統巴氏殺菌相比有差異性，但同未殺菌蛋液相比無差異性（p＞0.05），在食品加工中能保持相對穩定的性質。全蛋液的泡沫穩定性受蛋清液和蛋黃液中的多種蛋白影響[15]，蛋黃和蛋清混合后，熱穩定性有所提高，因此，超高溫巴氏殺菌未導致蛋白大量聚集，并且提升水-空氣界面膜的穩定性，膜破裂程度降低[16]。并且在儲藏期間，卵黏蛋白-溶菌酶復合物解體，蛋白質分子柔韌性增加，泡沫穩定性相對穩定，無明顯變化趨勢[17]。

2.2.2 超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏期間乳化性及乳化穩定性變化

乳化性和乳化穩定性是蛋液的另一個重要功能性質，本文比較了超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌對全蛋液乳化性及乳化穩定性的影響，觀察不同處理方式的全蛋液儲藏期間乳化性及乳化穩定性的變化見圖3。

圖3 全蛋液隨儲藏時間延長乳化性（EAI）及乳化穩定性（ESI）的變化情況Fig.3 Changes in emulsification and emulsification stability of liquid whole egg with storage time

由圖3 可知，第0 周時超高溫巴氏殺菌全蛋液及傳統巴氏殺菌全蛋液與未殺菌蛋液相比，乳化性顯著下降，而它們兩者之間無差異（p＞0.05）。0～6 周超高溫巴氏殺菌全蛋液與傳統巴氏殺菌全蛋液乳化性先上升后下降，在儲藏第3 周時達到最大值0.28。儲藏前期，隨著儲藏時間的延長，疏水基減少，蛋白質形成的聚合物解離，全蛋液的乳化性升高。儲藏后期，蛋白變性導致結構展開，表面疏水性增加，通過疏水作用會使變性的蛋白質形成聚合物，從而降低分子柔韌性，因此蛋清液乳化活力降低。超高溫巴氏殺菌全蛋液在冷藏條件下乳化性與傳統巴氏殺菌相比無顯著性差異，可在商業生產中得到較好的應用。

挑選好的青圓椒采用高處墜落法模擬機械損傷，從距地面1 m的高處墜落，然后以不同濃度1-MCP（8 μL/L、10 μL/L）熏蒸 24 h。預實驗發現 10 μL/L 1-MCP處理效果最佳。根據此條件，正式實驗的青圓椒隨機均分為2組，A組和B組。A組和B組均從距地面1 m的高處墜落，在室溫下（T=20 ℃，H=80%～85%）對A組青圓椒用10 μL/L 1-MCP熏蒸24 h。將處理后的A組和未處理的B組青圓椒裝入0.03 mm厚度的PE保鮮袋中，每袋裝5個青圓椒，折口包裝后于20 ℃下貯藏，每隔3 d測定相關生理生化相關指標。實驗重復三次，所測數據取平均值。

全蛋液經超高溫巴氏殺菌及傳統巴氏殺菌處理后隨儲藏時間增加，乳化穩定性先增加后減少然后趨于穩定，在第1 周達到最優值24.64、30.82。這可能是由于儲藏期間全蛋液中的蛋白質表面疏水性持續上升，硬度和黏度提高所致，一般認為蛋白質的疏水性越大，界面上吸附的蛋白質濃度越大，界面張力越小，乳狀液體系也就更穩定[18]，但隨著儲藏期間全蛋液濃厚蛋白水樣化，黏度降低，乳化體系的穩定性會受到破壞。全蛋液儲藏過程中除第0 周外，經超高溫巴氏殺菌處理后其乳化穩定性與傳統巴氏殺菌之間無顯著差異性（p＞0.05）。

2.3 超高溫巴氏殺菌對全蛋液儲藏期間理化性質的影響

2.3.1 超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏期間溶解度的變化

蛋白質的溶解度是蛋白功能性質的基礎，蛋白質只有在溶液中充分分散才能更好地與食物中其它組分相互作用[19]。一般認為，溶解性良好的蛋白往往具有較好的功能性質[20]。本文比較了超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌對全蛋液溶解度的影響，觀察不同處理方式的全蛋液儲藏期間溶解度的變化見圖4。

圖4 全蛋液隨儲藏時間延長溶解度的變化情況Fig.4 Changes in solubility of liquid whole egg with storage time

由圖4 可知，超高溫巴氏殺菌及傳統巴氏殺菌處理均導致全蛋液中溶解度降低，這是由于加熱導致蛋白展開，表面疏水性增加，因此溶解度降低。超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏1 周后有明顯的下降，后又上升之后保持穩定，后期溶解度有所上升可能是由于蛋液濃蛋白液化，濃厚蛋白向稀薄蛋白轉變，卵黏蛋白復合物降解，β-卵黏蛋白含量降低，不可溶的卵黏蛋白含量減少[21-22]。蛋液的溶解度對蛋液的功能性質有著直接的作用，溶解度變化趨勢與起泡性及泡沫穩定性的變化趨勢相符，而未殺菌全蛋液并未顯示出明顯的變化趨勢，3 種處理方式使全蛋液均在儲藏1 周時溶解度出現最低值。超高溫巴氏殺菌全蛋液溶解度在儲藏過程中除第6 周外，均與傳統巴氏殺菌法無顯著性差異（p＞0.05）。

2.3.2 超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏期間游離巰基的變化

游離巰基（-SH）含量的變化是二硫鍵變化的重要指標，二硫鍵的變化與蛋白質聚集有關，通過減少蛋白質分子間二硫鍵引起的分子結構的變化，可以改善氣泡中膜的形成[23]。本文比較了超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌對全蛋液游離巰基的影響，觀察不同處理方式的全蛋液儲藏期間游離巰基含量的變化見圖5。

圖5 全蛋液隨儲藏時間延長游離巰基的變化情況Fig.5 Changes in sulfydryl of liquid whole egg with storage time

2.3.3 超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏期間表面疏水性質的變化

疏水相互作用是維持蛋白質三級結構的最重要的作用力，其對于蛋白質的穩定性、構象與蛋白質的功能性質具有重要意義[24]。蛋白質分子表面疏水氨基酸形成疏水區域產生的表面性質影響蛋白質在極性不同的兩相之間的作用，主要有蛋白質的發泡性質和乳化性質等方面，是影響蛋白質表面性質的主要因素[26-27]。本文比較了超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌對全蛋液表面疏水性的影響，觀察不同處理方式的全蛋液儲藏期間表面疏水性的變化見圖6。

圖6 全蛋液隨儲藏時間延長表面疏水性的變化情況Fig.6 Changes in hydrophobic of liquid whole egg with storage time

由圖6 可知，超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌全蛋液表面疏水性變化趨勢為先降低后上升，表面疏水性最低值分別出現在第4 周為24 776，第1 周為24 119，未殺菌全蛋液儲藏期間表面疏水性呈降低趨勢。超高溫巴氏殺菌全蛋液表面疏水性在前3 周內高于傳統巴氏殺菌及未殺全菌蛋液，這可能是由于加熱導致全蛋液中蛋白質空間結構變化，疏水性區域暴露，表面疏水性增加，第4 周開始低于傳統巴氏殺菌全蛋液可能是由于超高溫巴氏殺菌全蛋液隨著時間延長，游離巰基含量降低，疏水基團含量減少，造成表面疏水性含量降低，同時蛋白質之間也可能通過疏水作用發生聚集，疏水性降低。后期可能是蛋白質變性程度加大，疏水結構暴露，表面疏水性增加。

2.3.4 超高溫巴氏殺菌全蛋液儲藏期間SDS-PAGE電泳的變化

為了進一步探討超高溫巴氏殺菌對全蛋液造成的影響，本文比較了超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌、未殺菌對全蛋液SDS-PAGE 的影響，觀察不同處理方式的全蛋液儲藏期間SDS-PAGE 的變化見圖7。

圖7 全蛋液隨儲藏前及儲藏至第6 周SDS-PAGE 的變化情況Fig.7 Changes of SDS-PAGE before and after storage of whole egg liquid stored at 6th week

由圖7 可知，超高溫巴氏殺菌、傳統巴氏殺菌及未殺菌全蛋液在儲藏前并無明顯的蛋白變化，泳道2、3、4 中無明顯的蛋白減少，蛋白變性聚集，表明超高溫巴氏殺菌并未對全蛋液中的蛋白質造成顯著影響。泳道5、6、7 之間可以看到，在10 kDa～15 kDa 處，有溶菌酶存在（14.7 kDa），而未殺菌全蛋液條帶相對于超高溫巴氏殺菌及傳統巴氏殺菌全蛋液條帶較淺，可能是由于儲藏過程中pH 值的變化造成的[28]。除此之外，其他條帶并無明顯變化。

3 結論

超高溫巴氏殺菌及傳統巴氏殺菌均對全蛋液中微生物有明顯的殺菌效果，但超高溫巴氏殺菌的殺菌效果更明顯，尤其是對沙門氏菌滅活效果更為突出。第0 周時超高溫巴氏殺菌與傳統巴氏殺菌全蛋液的起泡性、泡沫穩定性均顯著高于未殺菌，但二者之間沒有顯著差異，冷藏1 周后，三者起泡性均顯著下降，而泡沫穩定性呈上升趨勢，但是隨著冷藏時間的延長至6 周，三者均未呈現顯著變化。超高溫巴氏殺菌全蛋液乳化性及乳化穩定性為先增加后降低，在整個儲藏過程中，兩者間均無顯著性差異。不同殺菌方式對全蛋液中蛋白質溶解度、游離巰基的影響差異不顯著。超高溫巴氏殺菌既能有效滅活蛋液中的微生物，同時保障了超高溫巴氏殺菌全蛋液在儲藏過程中的功能性質與傳統巴氏殺菌相比無明顯變化，為超高溫巴氏殺菌全蛋液的工業生產和應用提供了理論基礎。