蓮房原花青素的超聲波輔助提取及其穩定性研究

黃愛妮，余萃，趙昕，李麗，杜楓，鄭樊

（武昌工學院城市建設學院，湖北武漢430065）

蓮房是蓮的干燥花托，蓮是湖北省傳統的水生經濟作物，蓮子的鮮銷和加工對地方經濟增長和農戶增收有重要貢獻。近年來，蓮子產業規模不斷壯大，而蓮房作為主要的副產物并未得到有效的開發利用，反而因隨意丟棄和焚燒造成資源浪費和環境污染[1-3]。

蓮房具有較強的抗氧化作用，可有效地抑制黑色素瘤細胞B16 的增殖，蓮房原花青素和銀杏內酯聯用能夠改善東莨菪堿所致的小鼠學習記憶障礙，與半胱氨酸聯用可有效地抑制氧化應激損傷，改善記憶障礙[4-9]。蓮房中含有的原花青素是一種氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，是迄今為止發現的最好的天然抗氧化劑之一，具有廣泛的生物活性和藥理作用[10-14]。

通過查詢相關資料發現，目前提取原花青素的方法主要有乙醇浸提法、酶提取法等，超聲波輔助法在蓮房原花青素提取中的應用比較少，相比較前面幾種方法，超聲波輔助提取法具有提取效率高、提取時間短、提取溫度低、保護有效成分等優點[15-20]。為了提高蓮房的生物利用度，以蓮房為原料，采用超聲波輔助法提取蓮房中的原花青素，通過單因素和正交試驗優化提取工藝參數，以確定超聲波輔助提取蓮房原花青素的最佳工藝條件，并對提取的蓮房原花青素的穩定性進行分析，為蓮房原花青素的開發利用提供一定的數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮房：市售；兒茶素標準品（純度＞98%）：合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

高速多功能粉碎機（JY-1000A）：浙江省永康市象珠松青五金廠；電子分析天平（AR2140）：奧豪斯儀器有限公司；可見分光光度計（V-1100）：上海美普達儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-2）：國華電器有限公司；離心機（THZ-82B）：金壇市醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蓮房原花青素的提取方法

將蓮房去籽，用蒸餾水沖洗干凈，撕成莖部相連的條狀，在60 ℃條件下烘至質量恒定，高速粉碎后過40 目篩，得到預處理后的蓮房粉。取一定量的蓮房粉，加入乙醇溶液，充分搖勻后進行超聲波處理，超聲波處理結束后，在4 200 r/min 狀態下離心5 min，離心后取上清液，剩下的部分再加入10 mL 蒸餾水，充分搖勻后，同樣的條件下再離心一次。合并上清液，干燥至恒重，得到蓮房原花青素產品。

1.3.2 蓮房原花青素含量的測定方法

1.3.2.1 兒茶素標準曲線的繪制方法

用無水乙醇溶解并定容20 mg 兒茶素標準品，得到1 mg/mL 的兒茶素標準貯備溶液。分別移取上述兒茶素標準貯備液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容，搖勻后，分別制得濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的標準品溶液。取干凈試劑瓶依次加入標準品溶液1 mL、3%香草醛-甲醇溶液5 mL、30%硫酸-甲醇溶液5 mL，混合后避光并在30 ℃水浴里反應15 min，在500 nm 波長處測定吸光值，以兒茶素濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制兒茶素的標準曲線。

1.3.2.2 蓮房原花青素提取率的計算

取一定量的蓮房原花青素產品，用無水乙醇稀釋至一定濃度作為待測液，取待測液1 mL，依次加入3%的香草醛-甲醇溶液5 mL，30%硫酸-甲醇溶液5 mL，混合后避光并在30 ℃水浴里反應15 min，在500 nm波長處測定其吸光值。用無水乙醇作為待測液，在相同條件下，作一組空白對照試驗。

利用兒茶素標準曲線的回歸方程計算提取液中原花青素的質量濃度，然后計算蓮房原花青素的提取率。

式中：n 為提取液稀釋倍數；c 為提取液中原花青素的質量濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；m 為蓮房粉質量，g。

1.3.3 蓮房原花青素提取工藝的優化研究

選擇乙醇溶液作為蓮房原花青素的提取劑，采用超聲波輔助進行提取，以蓮房原花青素的提取率為考察指標，分別考察乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、超聲時間（10、15、20、25、30 min）、超聲功率（100、150、200、250、300 W）、超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）等因素對蓮房原花青素提取效果的影響，在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數、料液比、超聲功率、超聲時間4 個因素進行正交試驗，進一步優化提取工藝參數。

1.3.4 蓮房原花青素穩定性的研究

蓮房原花青素的穩定性一方面體現在它的含量變化，可以用保存率進行判斷；另一方面體現在生物活性如抗氧化性。因此采用保存率和對DPPH 自由基的清除率來判斷原花青素的穩定性。將提取得到的蓮房原花青素分別在不同溫度、不同光照條件進行保存，計算原花青素的保存率和對DPPH 自由基的清除率，考察外界環境對原花青素穩定性的影響。

1.3.4.1 蓮房原花青素保存率的測定方法

按照樣品與試劑比為1∶5（mL/mL）的比例，在樣品中加入對應的1∶1（mL/mL）混合的1%濃度的香草醛和鹽酸溶液避光反應20 min 后取出靜置于室溫25 ℃，在500 nm 波長處測定其吸光度，將吸光度以y 帶入兒茶素標準品回歸方程中即可計算得出原花青素質量濃度x。原花青素保存率計算表達公式如下。

式中：μ 為蓮房原花青素保存率，%；x1為處理后蓮房原花青素質量濃度，mg/mL；x0為處理前蓮房原花青素質量濃度，mg/mL。

1.3.4.2 蓮房原花青素對DPPH 自由基的清除率測定方法

將配制好的DPPH 甲醇溶液與待測液按照39∶1（mL/mL）快速充分混勻后，在紫外分光光度計設置波長為515 nm 下測定30 min 時的試驗組吸光值A1，對照試驗用蒸餾水代替樣品，測出對照組吸光值為A2，用無水乙醇作為空白組，測空白組吸光值為A0。原花青素對DPPH 自由基的清除率計算公式如下。

式中：C 為DPPH 自由基清除率，%；A1為試驗組吸光值；A2為對照組吸光值；A0為空白組吸光值。

2 結果與分析

2.1 兒茶素標準曲線

采用1.3.2.1 的方法，繪制出兒茶素的標準曲線如圖1 所示。

圖1 兒茶素標準曲線Fig.1 Standard curve of catechins

測定標準曲線為y=2.396 4x+0.005 5，式中：x 為兒茶素的質量濃度，mg/mL；y 為500 nm 處吸光值。R2=0.998 3。

2.2 蓮房原花青素提取工藝優化的單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對蓮房原花青素提取率的影響

取預處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變乙醇體積分數為40%、50%、60%、70%和80%，計算蓮房原花青素的提取率，試驗結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of procyanidins

從圖2 可以看出，當乙醇體積分數在40%到50%時，隨著乙醇體積分數的增大，原花青素的提取率也隨之增大；當乙醇體積分數在50%到80%時，隨著乙醇體積分數的增大，原花青素提取率在逐漸減小。這可能是由于原花青素易溶于水，但植物中的原花青素通常與蛋白質多糖等形成氫鍵，有機溶劑具有斷裂氫鍵的作用，因此乙醇-水的復合溶劑體系有利于原花青素的提取。隨著乙醇體積分數的增加，破壞氫鍵能力增大，然而水穿透植物細胞的能力減弱，因此乙醇體積分數增大會導致原花青素的提取率減小。由此可見，選擇乙醇體積分數為50%最為適宜。

2.2.2 料液比對蓮房原花青素提取率的影響

取預處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），計算蓮房原花青素的提取率，試驗結果見圖3。

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圖3 料液比對原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of procyanidins

從圖3 可以看出，當料液比在1∶10（g/mL）到1∶25（g/mL）時，隨著溶劑的增大，原花青素提取率也隨之增大，可能是由于溶劑量的增加有利于增大原花青素與溶劑的接觸面和溶液的傳質推動力，從而提高了原花青素的提取率；而當料液比在1∶25（g/mL）到1∶30（g/mL）時，原花青素提取率開始下降，可能是因為隨著溶劑量的增加超聲波破碎細胞的阻力增加，使細胞破碎程度下降，從而降低了原花青素的提取率。由此可見，選擇料液比為1∶25（g/mL）最為適宜。

2.2.3 超聲時間對蓮房原花青素提取率的影響

取預處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變超聲時間為10、15、20、25、30 min，計算蓮房原花青素的提取率，試驗結果見圖4。

圖4 超聲時間對原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of procyanidins

從圖4 可以看出，當超聲時間在10 min 到25 min時，隨著超聲時間的增大，原花青素的提取率也不斷增大。超聲時間超過25 min 后，原花青素提取率增長曲線趨于平緩，這可能是因為超聲時間為25 min 時蓮房粉中原花青素已被基本提取，所以繼續延長超聲時間，對蓮房中的原花青素的提取效果影響較小，因此，選擇超聲時間為25 min 最為適宜。

2.2.4 超聲功率對蓮房原花青素提取率的影響

取預處理后的蓮房粉，加入一定量的乙醇溶液，采用超聲波進行輔助提取，保持其它條件不變，分別改變超聲功率為100、150、200、250、300 W，計算蓮房原花青素的提取率，試驗結果見圖5。

圖5 超聲功率對原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of procyanidins

從圖5 可以看出，當超聲功率在100 W 到250 W時，隨著超聲功率的增大，原花青素提取率也隨之不斷增大；當超聲功率在250 W 到300 W 時，隨著超聲功率的不斷增大，原花青素提取率反而呈下降趨勢。在超聲功率為250 W 時，提取率最大。因此，選擇超聲功率為250 W 最為適宜。

2.2.5 超聲溫度對蓮房原花青素提取率的影響

圖6 超聲溫度對原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of procyanidins

從圖6 可以看出，當超聲溫度在20 ℃到40 ℃時，隨著超聲溫度的增加，原花青素提取率也隨之不斷增加；在超聲溫度為40 ℃時，提取率最高。這可能是因為隨著溫度升高，增大了蓮房表皮細胞組織的滲透性，使表皮組織更容易分解，從而促進原花青素的釋放，使原花青素提取率增大，但過高的溫度會導致原花青素分解，使原花青素提取率減小。由此可見，選擇超聲溫度為40 ℃最為適宜。

2.3 蓮房原花青素提取工藝優化的正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數、料液比、超聲功率、超聲時間4 個因素，以蓮房原花青素的提取率作為考察指標，設計正交試驗。因素水平表見表1，試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

由正交試驗的結果分析可得到超聲波輔助提取蓮房原花青素的最佳工藝參數為：乙醇體積分數50%、料液比1 ∶25（g/mL）、超聲功率250 W、超聲時間30 min。

為了驗證正交試驗得到的最佳工藝參數，在最佳工藝條件下進行驗證試驗，測定蓮房原花青素平均提取率為6.45%，高于正交表中的最佳提取率，說明采用正交試驗優化超聲波輔助提取蓮房原花青素的工藝是可靠的。

2.4 蓮房原花青素穩定性的分析結果

2.4.1 保存溫度對蓮房原花青素穩定性的影響結果與分析

保持其它條件不變，將蓮房原花青素分別在10、30、50、70、90 ℃的溫度下進行保存，考察溫度對蓮房原花青素穩定性的影響，計算不同溫度保存后的蓮房原花青素的保存率和對DPPH 自由基的清除率，試驗結果如圖7 所示。

圖7 保存溫度對蓮房原花青素保存率和DPPH 自由基清除率的影響Fig.7 Effect of storage temperature on the preservation rate and DPPH clearance rate of procyanidins

由圖7 可以看出，當保存溫度越來越高時，蓮房原花青素保存率和DPPH 自由基清除率都呈現不同程度的明顯下降趨勢，其中突出表現在10 ℃到30 ℃的過程中原花青素保存率從94.1%下降到63.1%，下降程度較大；對DPPH 自由基的清除率也有一定程度的降低。表明隨著溫度的上升，蓮房原花青素降解程度會變大，穩定性下降。因此，蓮房原花青素在運輸、儲存以及加工應用中應該盡量在較低的溫度下進行。

2.4.2 光照對蓮房原花青素穩定性的影響結果與分析

保持其它條件不變，將蓮房原花青素分別進行避光處理、室內自然光處理和室外太陽光處理，考察光照對蓮房原花青素穩定性的影響，計算5 d 中不同光照條件下的蓮房原花青素保存率和DPPH 自由基清除率，試驗結果如圖8 和圖9 所示。

圖8 光照對蓮房原花青素保存率的影響Fig.8 Effect of light on the preservation rate of procyanidins in lotus

圖9 光照對蓮房原花青素DPPH 自由基清除率的影響Fig.9 Effect of light on DPPH radical scavenging rate of procyanidins in lotus

由圖8 可以看出進行光照處理后，隨著保存時間越來越長，蓮房原花青素保存率都呈現緩慢下降的趨勢。在避光處理的情況下，保存率下降的幅度最小，僅從96.1%降到85.1%，其次是室內自然光，下降幅度最大的是室外太陽光，從88.2%降到了73.2%，因此避光保存可以減少蓮房原花青素質量濃度的改變，即可以減少其降解程度，使其穩定性更好。

由圖9 可以看出，隨著光照時間的增長，避光處理的蓮房原花青素DPPH 自由基清除率變化波動很小，只從56.3%降到54.5%，室內自然光次之，室外太陽光對DPPH 自由基清除率影響相對較大，從41.2%下降到了28.4%。因此，由上述分析可以得出，光照對蓮房原花青素保存率的影響偏大，對DPPH 自由基清除率的影響總體較小，避光處理更適合蓮房原花青素的保存。

3 結論

將蓮房進行預處理后，以乙醇為提取劑進行超聲波輔助提取，采用兒茶素作為標準品進行對照計算蓮房原花青素的提取率，通過單因素試驗和正交試驗對提取工藝進行了優化。試驗結果表明，蓮房原花青素的最佳提取工藝參數為：乙醇體積分數50%、料液比1 ∶25（g/mL）、超聲功率250 W、超聲時間30 min，在此條件下，蓮房原花青素提取率為6.45%。對提取的蓮房原花青素的穩定性進行了分析，結果表明，隨著溫度的上升，蓮房原花青素的穩定性會降低；室外太陽光對蓮房原花青素的穩定性影響較大。因此，蓮房原花青素在運輸、儲存以及加工應用中應該盡量在較低的溫度和避光的條件下進行。