超聲波輔助酶法優化黃精多糖提取工藝的研究

劉日斌，張宇鵬，馬崇堅，陳曉遠*，葉俊

（1.韶關學院英東食品學院，廣東韶關512005；2.韶關市粵北土壤土地工程技術研究中心，廣東韶關512005；3.韶關學院英東生物與農業學院，廣東韶關512005）

黃精屬（Polygonatum）植物系百合科（Liliaceae）多年生草本植物。包含有滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl）、黃精（Polygonatum sibiricum Red）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）[1]。黃精作為傳統的中藥材，具有補氣養陰、益腎、健脾、潤肺等功效。同時，黃精作為藥食同源的食材，又具有解熱消暑、改善記憶力、提高免疫力等功能[2-4]。黃精的化學成分主要包括多糖、黃酮、木脂素、蒽醌、生物堿、揮發性油脂等[5-6]。其中，黃精多糖被認定為具有抗氧化、抗炎、降抗動脈粥樣硬化、抗病毒、抑制癌細胞、保肝等作用[7-8]。

黃精多糖的含量是評價黃精質量的重要指標之一，目前黃精多糖的提取方法研究較多的主要有水提醇沉法、堿提取法、酶提取法、閃式提取法、超聲波輔助提取法、超聲微波協同輔助提取法等。超聲波輔助提取工藝具有簡單、環保、快速高效等特點，在很多物質提取領域有比較好的應用。酶提取法具有反應條件溫和、環境友好，提取效率高等特點。本試驗將超聲波輔助提取法和酶提取法結合提取黃精多糖，采用單因素試驗和正交試驗進行提取工藝綜合優化，為黃精多糖的開發利用提供一定的試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

九蒸九曬黃精：市購；木瓜蛋白酶（酶活力≥100 000 U/g）、纖維素酶（酶活力≥30 000 U/g）、異抗壞血酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉：廣東味多美食品配料有限公司；葡萄糖（標準品）：成都艾科達化學試劑有限公司；濃硫酸：衡陽市凱信化工試劑有限公司；無水乙醇、95%乙醇：天津市大茂化學試劑廠；硫酸亞鐵：天津科密歐化學試劑有限公司；水楊酸：洛陽市化學試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 設備

ZD-3 自動電位滴定儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；PS-40AL 超聲波清洗機：深圳市華深科工設備有限公司；BS210S 電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；V-5000 可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；DHG-9076 電熱恒溫鼓風干燥箱：江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；HH-6 數顯恒溫水浴鍋、JJ-2萬能粉碎機：常州國華電器有限公司；RE-52B 旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器設備有限公司；TD25-WS 離心機：湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃精多糖的提取率及含量測定

1.3.1.1 黃精多糖的提取

將購買的新鮮干黃精放入70 ℃烘箱中再次烘干2 h，取部分粉碎、過40 目篩裝入自封袋中備用。按試驗要求準確稱取2.000 0 g 粉碎好的黃精置于三角瓶中，按比例加入一定量的純凈水，按一定配比加入木瓜蛋白酶和纖維素酶，調節pH 值后放入功率240 W超聲波提取器中，設置好溫度和時間進行黃精多糖提取。提取結束后，95 ℃水浴10 min 滅酶，趁熱用200 目絹布過濾。濾液于60 ℃下真空旋轉蒸發濃縮，濃縮至濃縮液體積小于20 mL，轉移至量筒中，并用少量蒸餾水潤洗剩余的濃縮液，合并濃縮液并定量到20 mL，倒入250 mL 三角瓶中，加入80 mL 無水乙醇，攪拌均勻后靜置2 h，4 000 r/min 離心10 min，離心后取沉淀，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚洗滌，烘干得黃精多糖[9-10]。

1.3.1.2 葡萄糖標準溶液的測定

采用苯酚-硫酸法測定[11]。準確稱取0.100 0 g 葡萄糖干燥標準品置于100 mL 容量瓶內，加入蒸餾水溶解，并稀釋到刻度，混勻。取上述配制好的葡萄糖溶液10 mL 稀釋至50 mL 得到葡萄糖標準溶液。分別取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 上述標準溶液于10 mL具塞試管中，然后分別加入蒸餾水至各管溶液體積達2 mL，同時往各管中加入1.0 mL 6%苯酚溶液，充分混勻，迅速加入5.0 mL 濃硫酸溶液，混勻，靜置5 min 后放入沸水浴中加熱15 min，取出冷卻，備用。單獨取2.0 mL 蒸餾水作為對照組，按上述操作步驟進行相同操作，最后將所有溶液在487 nm 條件下測定其吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，測得的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1 所示。得回歸方程Y=11.643X-0.001 5，R2=0.994，在0～0.18 mg 濃度范圍內有良好的線性關系。

圖1 葡萄糖溶液標準濃度曲線Fig.1 Standard concentration curve of glucose solution

1.3.1.3 多糖含量及提取率的測定

準確稱取30 mg 干燥、冷卻的黃精多糖樣品，定容得到100 mL，用移液管量取黃精多糖溶液1 mL，按照1.3.1.2 葡萄糖標準溶液的測定方法進行測定，同時做好空白試驗，利用葡萄糖標準溶液的回歸方程等進行計算[12]。

式中：X 為測定溶液中的多糖溶液濃度，mg/mL；D為粗糖樣品溶液的稀釋倍數，為50；B 為測定溶液多糖樣品的稱取質量，g；W 為粗糖樣品的質量，g。

多糖提取率/%=M/[F×（100-G）/100]×100

式中：M 為多糖含量，g；F 為黃精粗多糖樣品的質量，取5 g；G 為樣品的水分含量，%。

1.3.1.4 水分含量的測定

參照國家標準GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中“第一法直接干燥法”進行測定。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 提取方法的選擇

在固定料液比為1 ∶15（g/mL）和溶液pH 5.0 條件下，分別考察超聲波輔助提取（240 W 超聲波50 ℃提取40 min、沸水浴提取20 min）、超聲波輔助酶法提取[酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=1 ∶1，質量比）3%、240 W、50 ℃超聲波提取40 min、沸水浴滅酶20 min]、常規酶法提取[酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=1 ∶1，質量比）3%（酶與底物質量比）、50 ℃水浴提取40 min、沸水浴滅酶20 min]3 種不同提取方法對黃精多糖提取率的影響。

1.3.2.2 木瓜蛋白酶和纖維素酶質量比的選擇

在固定料液比為1 ∶15（g/mL）、溶液pH 5.0、50 ℃超聲波輔助提取40 min、沸水浴滅酶20 min、復合酶（木瓜蛋白酶與纖維素酶）總量3%添加量條件下，分別按木瓜蛋白酶與纖維素酶2 ∶8、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、8 ∶2（質量比）提取黃精多糖，研究木瓜蛋白酶與纖維素酶添加質量比對黃精多糖提取率的影響。

1.3.2.3 復合酶酶解pH 值的選擇

在固定3%復合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=6 ∶4，質量比）、料液比為1 ∶15（g/mL）、50 ℃超聲波輔助提取40 min、沸水浴滅酶10 min 條件下，分別將酶解pH 值調至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 提取黃精多糖，研究酶解pH 值對黃精多糖提取率的影響。

1.3.2.4 復合酶添加量的選擇

在固定料液比為1 ∶15（g/mL）、pH 5.0、50 ℃超聲波輔助提取40 min、沸水浴滅酶10 min 條件下，分別添加復合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=6 ∶4，質量比）2%、3%、4%、5%、6%、7%提取黃精多糖，研究復合酶添加量對黃精多糖提取率的影響。

1.3.2.5 酶解溫度的選擇

在固定料液比為1 ∶15（g/mL）、6%復合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=6 ∶4，質量比）添加量、pH 5.0、超聲波輔助提取40 min，沸水浴滅酶10 min 條件下，分別按40、45、50、55、60、65 ℃進行黃精多糖提取，研究酶解溫度對黃精多糖提取率的影響。

1.3.2.6 酶解時間的選擇

在固定料液比為1 ∶15（g/mL）、6%復合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=6 ∶4，質量比）添加量、pH 5.0、酶解溫度為65 ℃、沸水浴滅酶10 min 條件下，分別按20、30、40、50、60、70 min 提取黃精多糖，研究酶解時間對黃精多糖提取率的影響。

1.3.2.7 料液比的選擇

在固定6%復合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=6 ∶4，質量比）添加量、pH 5.0、酶解溫度為65 ℃、酶解時間為50 min、沸水浴滅酶10 min 條件下，分別按料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）提取黃精多糖，研究料液比對黃精多糖提取率的影響。

1.3.3 正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，選取復合酶添加量、酶解溫度、酶解時間和料液比作為考察因素，采用L9（34）進行正交設計，以多糖提取率為指標，進行試驗。正交試驗因素水平設計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平Table 1 L9（34）orthogonal experimental factor level

1.4 數據處理

每個試驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。正交試驗設計與數據分析采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取方法對黃精多糖提取率的影響

不同提取方法對黃精多糖提取率的影響見圖2。

圖2 不同提取方法對黃精多糖提取率的影響Fig.2 The effect of different extraction methods on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

由圖2 可知，超聲波輔助酶法提取多糖輔助提取率最高，常規酶法的提取率次之，超聲波輔助提取法最低，這說明超聲波輔助提取與酶法提取具有較好的協同作用，超聲波的空化效應對酶的作用影響不大，兩者結合使用可以很好的提高提取效果，這與陶濤等[13]研究結果一致。因此選擇超聲波輔助酶法提取進行優化工藝條件是可行的。

2.1.2 木瓜蛋白酶和纖維素酶質量比對黃精多糖提取率的影響

木瓜蛋白酶和纖維素酶質量比對黃精多糖提取率的影響見圖3。

圖3 木瓜蛋白酶和纖維素酶質量比對黃精多糖提取率的影響Fig.3 The effect of the mass ratio of papain and cellulase on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

由圖3 可知，在一定條件下，木瓜蛋白酶比例的增加，能提高黃精多糖提取率。在木瓜蛋白酶和纖維素酶比例為6 ∶4（質量比）時，黃精多糖提取率最高，達15.48%，可能是該比例下，纖維素酶可以適當的破壞黃精的細胞壁，使得以糖蛋白形式存在的多糖得以脫離細胞游離出來，游離出來的糖蛋白又剛好能被木瓜蛋白酶很好的分解成多糖分子和蛋白質分子。因此，可以得到較多的多糖分子。該結果與苑路等[14]研究的結果類似。當木瓜蛋白酶比例持續升高時，黃精多糖提取率有明顯下降，原因可能是酶與酶之間的競爭性抑制作用使酶的整體酶解效率降低。綜合考慮，選擇木瓜蛋白酶和纖維素酶比例6 ∶4（質量比）為最佳復合酶復配比例。

2.1.3 復合酶酶解pH 值對黃精多糖提取率的影響

pH 值對黃精多糖提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，pH 值作為影響酶解效率的重要影響因子。當pH 值為5.0 時，黃精多糖提取率最高。在其他不同pH 值條件下的多糖提取率均有不同程度的下降。其中在pH 值大于5.0 時的下降速率較大，這可能是偏酸性條件下更適合該復合酶的酶解條件。因此選擇pH 值為5.0 作為復合酶的最佳酶解pH 值。2.1.4 復合酶添加量對黃精多糖提取率的影響復合酶添加量對黃精多糖提取率的影響見圖5。

圖4 pH 值對黃精多糖提取率的影響Fig.4 The effect of pH on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

圖5 復合酶添加量對黃精多糖提取率的影響Fig.5 The effect of compound enzyme addition on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

由圖5 可知，在一定條件下，隨著復合酶添加量的增加，黃精多糖提取率不斷提高。復合酶添加量由3%增加到6%的過程中，多糖提取率增加較為緩慢。當復合酶添加量達到6%時，多糖提取率達到最高。而隨著復合酶的繼續增加，酶解效率卻出現了微量的下降，可能是由于競爭性抑制作用使酶解效率降低。因此，選擇6%復合酶添加量為最佳酶添加量。

2.1.5 酶解溫度對黃精多糖提取率的影響

酶解溫度對黃精多糖提取率的影響見圖6。

圖6 酶解溫度對黃精多糖提取率的影響Fig.6 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

如圖6 所示，酶解溫度對黃精多糖的提取有一定的影響，當溫度在40 ℃時，黃精多糖提取率較低，這可能是由于溫度較低酶活性較低、分子運動也相對較弱。當溫度升高至60 ℃時，黃精多糖的提取率最高。而溫度再次升高至65 ℃時，黃精多糖提取率有所下降，這可能是由于溫度太高對酶的活性位點起到破壞作用。因此選擇60℃作為最佳酶解溫度。

2.1.6 酶解時間對黃精多糖提取率的影響

酶解時間對黃精多糖提取率的影響見圖7。

圖7 酶解時間對黃精多糖提取率的影響Fig.7 The effect of hydrolysis time on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

如圖7 所示，黃精多糖的提取率隨著酶解時間的延長不斷提高，當酶解時間由20 min 逐漸延長至40 min時，黃精多糖的提取率增幅較快。隨著時間繼續延長，黃精多糖的提取率增幅越來越緩慢，這是由于酶解時間達到50 min 的時候，黃精粉末中的黃精多糖基本都被提取到溶液中。因此選擇50 min 作為最佳酶解時間。

2.1.7 料液比對黃精多糖提取率的影響

料液比對黃精多糖提取率的影響見圖8。

圖8 料液比對黃精多糖提取率的影響Fig.8 The effect of material-liquid ratio on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide

如圖8 所示，黃精多糖的提取率隨著提取液溶劑比例的增加不斷提高，當料液比由1 ∶10（g/mL）到1 ∶15（g/mL）時，黃精多糖的提取率迅速提高，這是由于提取液增加可以增加濃度差，使得更多溶質可以溶解出來。當料液比達到1 ∶25（g/mL）之后，提取率趨向穩定，考慮到料液比過大，后期提取液的分離時間加長，能耗大，同時提取液消耗也更多，故選擇1 ∶25（g/mL）作為最佳料液比。

2.2 黃精多糖提取工藝優化

以黃精多糖提取率作為評價指標，試驗結果見表2。

表2 正交試驗設計方案及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

由表2 可知，影響黃精多糖提取率的主次因素排列順序為提取料液比＞酶解時間＞復合酶添加量＞酶解溫度，最優組合是A2B3C3D3。即復合酶添加量6%、酶解溫度65 ℃、酶解時間55 min、料液比1 ∶30（g/mL）。對此最佳條件進行補充驗證試驗，得到黃精多糖提取率為25.63%，大于表2 中第4 組（A2B1C2D3）得到的提取率。因此最終確定最優組合為A2B3C3D3，即黃精多糖提取率為25.63%。

3 結論

超聲波輔助酶法的多糖提取率明顯要比常規酶法和超聲波輔助提取法的要高，影響超聲波輔助酶法提取黃精多糖的主次因素順序為提取料液比＞酶解時間＞復合酶添加量＞酶解溫度，黃精多糖的最優提取條件為復合酶添加量6%，酶解溫度65 ℃，酶解時間55 min，料液比1 ∶30（g/mL），得到黃精多糖提取率為25.63%。