黑曲霉3.316β-葡萄糖苷酶底物親和性研究

侯林燕，朱鳳妹

（河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島066600）

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase），因其能將結合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵水解，所以也被稱為β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它屬于纖維素酶系的一種，能夠水解纖維二糖來減少纖維素水解過程中的可逆限制。該酶可以從微生物和動植物中獲得，比如細菌[1]、真菌[2]、霉菌[3]、水果、龍井茶葉[4-5]、昆蟲[6]等。來源不同的β-葡萄糖苷酶所呈現的蛋白質結構存在差異，從而導致β-葡萄糖苷酶的酶學性質不同。根據酶作用底物的糖苷鍵的不同可以將β-葡萄糖苷酶分成只水解烴基-β-葡萄糖苷鍵的酶、只水解芳香基-β-葡萄糖苷鍵的酶和既能水解烴基-β-葡萄糖苷又能水解芳香基-β-葡萄糖苷[7-8]的酶。底物種類的不同與β-葡萄糖苷酶發生反應時的連接方式也不同。通常采用分子對接了解小分子配體與大分子受體的連接方式[9-11]，分子對接的常用軟件有AutoDock、LeDOCK、MOE Dock 等[12-14]，可視化軟件有MOE[15]、Pymol[16]等。本次試驗采用分子對接了解3 種底物與β-葡萄糖苷酶的連接方式，從分子角度找到兩者結合穩定的原因，為β-葡萄糖苷酶結構性質的理論研究提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger 3.316）：中國菌種保藏中心；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside，pNPG）：上海華藍化學科技有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：上海羽朵生物科技有限公司；纖維二糖：MERCK 公司；水楊苷：RHAWN 公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）：武漢克米克生物醫藥技術有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 底物與酶的分子對接

在能力最小化基礎上將二維結構轉化為三維結構，利用LigX 優化靶的質子化狀態和氫的取向，殘基Asp280 附近是結合區域。AMBER10 ∶EHT 的力場和反應場（R 場）的隱式溶劑化模型用于對接前，采用半柔性對接方式，對位置進行約束，但允許受體口袋的側鏈根據配體構象移動。側鏈原子束縛到原始位置的重量為10，過渡態由London dG 評分，對前30 個復合物過渡態進行力場細化，然后對GBVI/WSA dG 重新評分，結果以MOE 軟件可視化。

1.3 酶活測定方法

DNS 法測定酶活性[17]：配制0.02 mmol/L，pH 4.5 的水楊苷溶液，取2 mL 底物溶液與1 mL 酶液于60 ℃水浴，加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min 終止反應，測定OD540值。將滅活的酶液作為空白對照處理。

pNPG 酶活測定方法[18]：50 μL pNPG 的溶液加入1.5 mL 的pH 4.5 的緩沖液，在60 ℃下預熱10 min。加入500 μL 的酶液，反應10 min，取410 μL 混合液，加入490 μL 的1 mol/L Na2CO3終止反應，測定OD400值。

纖維二糖測定方法[19]：取pH 4.5，濃度為4 mmol/L的纖維二糖溶液70 μL 加入酶液70 μL，于60 ℃下發生反應，加入2.1 mL 的葡萄糖氧化酶生化分析顯色液，反應10 min，測定OD520值。

1.4 標準曲線的測定

1.4.1 DNS 法葡萄糖標準曲線的測定

測定還原糖采用DNS 比色法，將不同濃度的葡萄糖溶液（mg/mL）在540 nm 波長下測量OD 值。

1.4.2 pNP 標準曲線的測定

測定pNP 采用pNPG 法，將不同濃度的pNP（mmol/L）于400 nm 波長處測量OD 值。

1.4.3 葡萄糖氧化酶法葡萄糖標準曲線的測定

采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖標準曲線，將不同濃度的葡萄糖溶液（mg/mL）在500 nm 波長下測量OD 值。

1.5 動力學參數測定

分別配制不同濃度的底物溶液，其中水楊苷濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L；pNPG 的濃度為1、2、5、7、10 mmol/L；纖維二糖的濃度為1、2、3、4、5 mmol/L；按1.3 酶活測定方法，酶與底物混合液在pH 4.5，溫度為60 ℃條件下反應，每隔2 min，加入各自對應的反應終止劑，分別測定OD540值、OD400值、OD520值。根據Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法求3 種底物的動力學參數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定結果

以葡萄糖濃度作為橫坐標，以吸光度值為縱坐標做標準曲線圖，得到的標準曲線方程為：y=0.431 5x-0.020 8（R2=0.994 4）；以pNP 濃度作為橫坐標，以吸光度值為縱坐標做標準曲線圖，得到的標準曲線方程為：y=6.594 4x-0.002 1（R2=0.998 8）。以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，得到標準曲線方程為：y=0.012x+2.213 6（R2=0.998 7）。

2.2 3 種底物與β-葡萄糖苷酶對接結果

2.2.1 纖維二糖與β-葡萄糖苷酶對接結果

纖維二糖與β-葡萄糖苷酶對接結果見圖1。

圖1 β-葡萄糖苷酶與纖維二糖的對接復合物Fig.1 Complex of β-glucosidase with cellobiose

如圖1A 所示，黑色圈內的環狀結構物為纖維二糖，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結果顯示纖維二糖在預定的結構“活性凹槽處”[20]與酶連接。利用MOE 軟件得到兩分子連接的二維結構圖。如圖1B 所示，與纖維二糖對接時，存在3 個氫鍵和3 個H-π 共軛。兩個氫鍵是由纖維二糖作為氫供體與Asp280 側鏈形成的，另一個氫鍵是由纖維二糖作為氫供體與Asp92 形成的。2 個H-π 共軛是Tyr511 同時與纖維二糖形成，另一個由Trp281 與纖維二糖形成。

2.2.2 水楊苷與β-葡萄糖苷酶對接結果

水楊苷與β-葡萄糖苷酶對接結果見圖2。

圖2 β-葡萄糖苷酶與水楊苷的對接復合物Fig.2 Complex of β-glucosidase with salicin

如圖2A 所示，黑色圈內的環狀結構物為水楊苷，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結果顯示水楊苷在預定的結構活性凹槽處與酶連接。二維結構如圖2B 可知，在對接時，存在4 個氫鍵，Asp92 作為氫受體與水楊苷相連2 個氫鍵，Asp280 作為氫受體與水楊苷相連1 個氫鍵，Glu509 作為氫受體和Tyr248 作為氫供體與水楊苷上的同一個羥基形成氫鍵。

2.2.3 pNPG 與β-葡萄糖苷酶對接結果

pNPG 與β-葡萄糖苷酶對接結果見圖3。

如圖3A 所示，黑色圈內的環狀結構物為pNPG，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結果顯示pNPG 在預定的結構活性凹槽處與酶連接。二維結構如圖3B，在對接時存在4 個氫鍵，Asp92 和Ser451 側鏈與底物不同羥基位點處分別形成一個氫鍵、Glu509 作為氫受體和Tyr248 作為氫供體同時與pNPG 上的羥基形成一個氫鍵。

圖3 β-葡糖苷酶與pNPG 的對接結果Fig.3 Complex of β-glucosidase with pNPG

2.2.4 3 種底物與β-葡萄糖苷酶對接分數

3 種底物與β-葡萄糖苷酶對接分數見表1。

表1 3 種底物與β-葡萄糖苷酶的對接分數Table 1 The docking score of three substrate with β-glucosidase

由表1 可知，纖維二糖的能量分數最小，在3 種底物與酶復合物中屬于最穩定的復合狀態，也就說明纖維二糖與酶的結合力在三者中最強。結合能量的大小與結合時形成的氫鍵和H-π 共軛有關，其中H-π 共軛即芳香氫鍵在對多肽和蛋白質穩定方面、提高底物的親和力和催化效率起著重要作用[21]。這可能是纖維二糖較水楊苷和pNPG 作為底物時與酶的復合物相對穩定的原因。

2.3 動力學參數測定

2.3.1 纖維二糖與β-葡萄糖苷酶動力學方程

以纖維二糖為底物時，以底物濃度（S）的倒數1/[S]作為橫坐標，以反應速度（V）的倒數1/V 為縱坐標，得到纖維二糖為底物時的動力學方程結果如圖4 所示。

2.3.2 水楊苷與β-葡萄糖苷酶動力學方程

以水楊苷為底物時，根據Lineweaver-Burk 雙倒數作圖，計算所得到的動力學方程結果如圖5 所示。

2.3.3 pNPG 與β-葡萄糖苷酶動力學方程

以pNPG 為底物時，根據根據Lineweaver-Burk 雙倒數作圖，計算得到的動力學方程結果如圖6 所示。

圖4 纖維二糖的動力學方程Fig.4 Kinetic equation of cellobiose

圖5 水揚苷的動力學方程Fig.5 Kinetic equation of salicin

圖6 pNPG 的動力學方程Fig.6 Kinetic equation of pNPG

根據3 個方程計算可得，纖維二糖、水楊苷和pNPG 3 種底物所對應的Km分別為5.567、5.820、1.527 mmol/L，則Km最小的為pNPG，這表明酶對pNPG 的親和力明顯高于酶對纖維二糖和水楊苷的親和力；最大反應速率由高到低依次為66.138、8.886 和1.013 μmol/（min·mg），則酶與纖維二糖為底物時的最大反應速率是酶與水楊苷和酶與pNPG 最大反應速率的7.44 倍和65.28倍；纖維二糖、水楊苷和pNPG 3 種底物所對應的催化效率分別為14.728、2.068 和0.377，這表明當以纖維二糖為底物時有最大的催化效率，且分別是以水楊苷和pNPG 為底物時的7.12 倍和39.07倍。

3 結論與討論

本研究采用分子對接將3 種β-葡萄糖苷酶的底物與該酶進行對接，從三維結構上初步了解β-葡萄糖苷酶與底物分子接觸發生反應時的連接方式，并通過動力學參數進行了試驗驗證。結果發現3 種底物均在β-葡萄糖苷酶的凹槽處進行了對接，其中在與水楊苷和pNPG 對接時，活性位點相鄰的Ser451、Tyr248、Asp92 和Asp98 會與底物形成氫鍵網絡。有的一個氨基酸與底物的兩個位點結合生成氫鍵，有的兩個氨基酸側鏈與底物的一個位點同時生成氫鍵，產生這樣的結果可能與不同氨基酸所帶電荷數以及所形成氫鍵類型有關[22-25]；在與纖維二糖對接時，除氨基酸與底物形成的3 個氫鍵外，生成了3 個H-π 共軛，由于陽離子-π 能夠增強周圍形成氫鍵的氨基酸側鏈的成鍵能力[26]，進而影響了酶的催化效率和反應速率。

通過對β-葡萄糖苷酶進行動力學參數分析可知，pNPG 最接近β-葡萄糖苷酶天然底物，纖維二糖為底物時，復合物結構最為穩定，催化效率以及反應速率也最高，這結果符合上述分子對接結果。本次試驗結果找到了β-葡萄糖苷酶的最適底物，并從分子方面解釋了底物與酶復合物連接的方式，同時通過試驗驗證了分子對接的可靠性，為以后β-葡萄糖苷酶的分子改造提供了設計方法與試驗基礎。