早孕期蛻膜免疫細胞譜及其與妊娠結局的相關性

馬靜文，王琳琳，張燕，武婭婭，陳聰，吳娟花，連若純，楊菁*，李龍飛*

(1.武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060；2. 深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045；3.深圳中山泌尿外科醫院婦產科，深圳 518045)

受精卵著床后，子宮內膜間質增殖再分化形成蛻膜組織，其結構與功能的正常對妊娠的建立和維持具有重要的意義[1]。胚胎攜帶有一半母方一半父方的基因，對于母體來說是一種獨特的同種異型移植物。在正常妊娠過程中，胚胎得以在母體子宮中存活發育而不發生免疫排斥反應有賴于母胎界面特殊的免疫耐受機制[2]。位于母胎界面的蛻膜組織內的免疫細胞在維持母體對胎兒的免疫耐受中起著重要的作用，妊娠前后免疫細胞譜的變化使得各類免疫細胞共同參與了妊娠的維持，而免疫微環境的失調則會導致妊娠失敗甚至發生流產。

本研究通過免疫組織化學法對正常黃體中期內膜、人工流產患者蛻膜及稽留流產患者蛻膜中各類免疫細胞標志物進行檢測，初步觀察各類免疫細胞標志物于妊娠前后的變化及與妊娠結局的關系，以期描繪出妊娠早期免疫細胞譜及免疫微環境改變對妊娠結局的影響，為臨床妊娠免疫失衡的預防和治療提供理論依據。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年9月至2018年9月在深圳中山泌尿外科醫院婦科收治的17例稽留流產患者(稽留流產組)、34例行人工流產的正常早孕患者(人工流產組)及同期于本院生殖醫學中心治療且首個IVF周期試孕成功的27例女性(正常內膜組)為研究對象。

診斷標準：(1)稽留流產(超聲診斷標準)：頭臀比≥7 mm，未見胎心搏動；宮內妊娠囊平均直徑≥25 mm，未見胚胎；宮內妊娠未見卵黃囊，2周后仍未見胚胎及胎心搏動；宮內妊娠可見卵黃囊，11 d后仍無胎心搏動。(2)人工流產：符合早孕診斷標準并自愿終止妊娠；符合人工流產術手術指征。

納入標準：(1)所有患者年齡20～40歲，流產組(人工流產組和稽留流產組)妊娠時間5～12周；(2)各組宮腔形態正常，無子宮畸形、粘連等器質性疾??；(3)無全身感染性疾病，取樣前3個月無任何用藥史，流產組均無自然流產及死胎史。排除標準：(1)有復發性流產病史；(2)有家族遺傳及系統性疾病等；(3)流產胚胎檢測有染色體異常。

二、研究方法

1.子宮內膜及蛻膜的收集：(1)子宮內膜：月經周期第10天起，尿LH及B超結合監測排卵情況，排卵后第7～8天利用子宮內膜取樣器(Gynetics，Belgium，比利時)刮取少量子宮內膜組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗去除組織表面血污。(2)蛻膜：患者行常規消毒、麻醉后取膀胱截石位，多普勒彩色超聲確認孕囊位置后行擴宮處理，在腹部B超的引導下，負壓吸引妊娠囊行刮宮術。將所得胚胎組織投入95%酒精中固定待病檢，分離蛻膜組織后待固定。

2.固定及包埋：將處理好的內膜/蛻膜組織于10%中性福爾馬林固定液固定4～6 h，將固定好的組織置于組織盒中放入全自動組織脫水機行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋待測。

3.免疫組化檢測：石蠟包埋的子宮內膜及蛻膜組織做4 μm厚度的切片，按照顯色試劑盒(Leica，美國)操作說明，運用自動免疫組織化學儀(Leica，Bond ΙΙΙ，美國)進行免疫組織化學染色實驗。具體實驗步驟如下：常規梯度脫蠟后，采用3%的過氧化氫試劑封閉內源性過氧化物酶15 min，10%的胎牛血清封閉20 min以阻斷非特異性染色；EDTA或檸檬酸抗原修復液進行微波加熱處理，采用如下一抗(表1)：CD56、CD68、CD83、CD8、Foxp3、CD1a 37℃孵育1 h后，加鼠、兔通用二抗37℃孵育30 min；再滴加DAB工作液顯色，至棕黃色時停止染色，蘇木素復染后氨水返藍，進行梯度酒精脫水，樹膠封片。

表1 抗體情況

4.免疫組化實驗結果判定：本研究采用Vectra自動病理成像定量分析系統(Perkin Elmer，美國)定量分析子宮內膜及蛻膜組織中各免疫細胞數量。首先低倍鏡掃描完整的切片，然后在高倍視野下(放大倍數×200)隨機采集30張圖像。使用InForm多光譜圖像分析軟件進行圖譜的光譜分析，準確測定各類不同的信號。根據每個免疫靶標的著色不同，對不同玻片的染色進行不同的光譜拆分，訓練軟件自動識別每個視野中的組織區域、空白區域，并計數組織區域內的所有的子宮內膜或蛻膜細胞及陽性細胞。最后，選取組織區域所占面積超過80%全視野的20張圖像納入統計分析。將陽性細胞率定義為陽性免疫細胞數/子宮內膜或蛻膜細胞總數×100%，最終計算這20張圖像的陽性免疫細胞率的平均值作為該免疫細胞的陽性率。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般資料比較

本研究共納入78例患者，其中正常內膜組27例，人工流產組34例，稽留流產組17例。正常內膜組：平均年齡(31.6±4.2)歲；自然黃體中期。人工流產組：平均年齡(32.2±6.5)歲；孕周5～9周，平均孕周(6.3±1.0)周。稽留流產組：平均年齡(33.8±4.6)歲；孕周6～9周，平均孕周(6.8±0.7)周。各組患者間一般資料均無統計學差異(P>0.05)。

二、子宮內膜及蛻膜組織中免疫細胞的數量變化

1.妊娠前后免疫細胞譜的變化：在人工流產組中，CD56+細胞、CD68+細胞及CD83+細胞這3類免疫細胞數均高于正常內膜組，差異均具有統計學意義(P<0.001)；而CD8+細胞、Foxp3+細胞和CD1a+細胞這3類免疫細胞數與正常內膜組相比均無顯著變化(P>0.05)(圖1、表2)。

正常內膜組為黃體中期內膜組織，人流/稽留組均為孕7周蛻膜組織。A：CD56+陽性細胞率；B：CD68+陽性細胞率；C：CD83+陽性細胞率；D：CD8+陽性細胞率；E：Foxp3+陽性細胞率；F：CD1a+陽性細胞率。紅色箭頭所示為陽性細胞。組間比較，*P<0.05，#P<0.01，?P<0.001圖1 不同組間子宮內膜及蛻膜各類免疫細胞陽性率比較

表2 正常內膜組與人工流產組間子宮內膜/蛻膜組織各免疫細胞陽性細胞率比較(%)

2.稽留流產對妊娠免疫細胞譜的影響：稽留流產組蛻膜組織中CD68+細胞、CD8+細胞和Foxp3+細胞數均高于人工流產組，差異有統計學意義(P<0.05)；而CD56+細胞、CD83+細胞和CD1a+細胞數均無顯著性變化(P>0.05)(圖1、表3)。

表3 人工流產組與稽留流產組組間蛻膜組織各免疫細胞陽性細胞率比較(%)

三、蛻膜免疫細胞數量隨孕周的變化

以人工流產組蛻膜免疫細胞數為基準觀察蛻膜免疫細胞隨孕周的變化情況，其中孕5周檢測4例、孕6周20例、孕7周5例、孕8周3例、孕9周2例。對于CD56+細胞、CD68+細胞和CD83+細胞，孕5周開始顯著上升(P<0.05)后在5～9周未有明顯數量變化，其中CD83+細胞在孕9周又有明顯上升；對于CD8+細胞，孕8周開始顯著上升(P<0.05)后保持恒定數量；對于Foxp3+細胞，早孕期蛻膜中數量無顯著變化(P>0.05)；對于CD1a+細胞，早孕期蛻膜中數量在孕9周顯著下降(P<0.05)(圖2)。

不同孕周與黃體中期比較，*P<0.05，#P<0.01，?P<0.001圖2 早孕期蛻膜各類免疫細胞變化趨勢

討 論

妊娠早期的蛻膜化子宮內膜構成了母胎界面的重要成分，在維持妊娠的過程中，母胎界面大量的免疫細胞參與了母體免疫耐受的調節作用，使得胚胎在植入過程以及后續的妊娠過程中不被母體所排斥[3]。妊娠期母體子宮內膜的免疫細胞數量和功能會發生很大的變化，具體表現為免疫排斥的減弱和保護反應的增強，使母體與胎兒之間處于一種免疫平衡的狀態，有助于更好的維持妊娠[4]。而這種免疫平衡的狀態一旦被打破則會產生不良的妊娠結局。

CD56是一種神經細胞粘連因子，主要表達在所有的NK細胞、少部分的細胞毒性T淋巴細胞及一部分神經組織中[5]。它是NK細胞重要的表面標志物。在本研究中，在妊娠早期，NK細胞在母胎界面大量聚集，成為最主要的免疫細胞，在胚胎植入這一關鍵時期大量出現的NK細胞究竟扮演著什么樣的角色呢？蛻膜NK細胞是以分泌轉化生長因子-β(TGF-β)為主的NK3細胞[6]。TGF-β能夠誘導子宮內膜發生蛻膜樣變化，使滋養層向無侵蝕性的合體滋養層細胞分化；蛻膜NK細胞還能產生金屬蛋白酶抑制劑和纖溶酶原啟動抑制因子，借此調節金屬蛋白酶和纖溶酶的活性，抑制滋養層細胞的過度侵蝕；除此之外，蛻膜NK細胞還能分泌IFN-γ，在蛻膜化過程中發揮著對血管分化與生長的調控作用。這些機制使得胎兒組織能夠不被母體所排斥，維持了母體對半同種異體胎兒的耐受性[7]。妊娠早期增多的NK細胞在維持母胎免疫耐受中發揮著重要的作用。

巨噬細胞是母胎免疫耐受的核心細胞之一，它可通過識別耐受胚胎抗原從而直接影響妊娠結局，CD68是巨噬細胞表面重要的標志分子[8]。本研究中，蛻膜巨噬細胞成為第二大主要聚集的蛻膜免疫細胞。蛻膜巨噬細胞是子宮中重要的抗原提呈細胞，主要分布在子宮螺旋動脈外膜和血管壁中，有研究證實，在子宮螺旋動脈重塑的過程中，巨噬細胞先于初期滋養層細胞聚集于子宮螺旋動脈周圍[9]。在重塑過程中，蛻膜巨噬細胞能夠及時吞噬清除發生凋亡的血管平滑肌細胞和滋養層細胞碎片，防止炎性物質釋放到周圍組織引起炎性反應影響胚胎的發育。除了重要的吞噬作用來保護子宮組織環境，蛻膜巨噬細胞還能夠分泌多種細胞因子，包括與免疫調節有關的細胞因子：IL-1、IL-10和TNF-α，與血管生長相關的細胞因子：血管生成素、各類基質金屬蛋白酶，這些細胞因子在免疫應答、代謝與修復、血管生成等方面發揮著重要的作用[10]。雖然大量增多的巨噬細胞在維持母胎免疫耐受發揮重要作用，但我們的結果發現，稽留流產組患者蛻膜巨噬細胞數量相較于人工流產患者組有明顯的上升，與Svensson-Arvelund等[11]的研究中流產患者中巨噬細胞增多并活化導致流產的結果相一致。這些結果表明，妊娠早期母體巨噬細胞在子宮局部過多的激活和浸潤可能是導致自然流產和子癇前期等病理性妊娠的重要原因，但其具體機制仍有待進一步研究。

除了上述兩種重要的免疫細胞，樹突狀細胞在妊娠維持中也起著重要的作用，不僅能介導母體對外來抗原產生防御性免疫應答，更能介導蛻膜對胚胎的免疫耐受。在本研究中，將CD83作為成熟樹突狀細胞的標志物，CD1a作為未成熟樹突狀細胞的標志物來檢測兩類樹突狀細胞的表達情況，我們發現，成熟的樹突狀細胞在早孕期顯著增加，而未成熟樹突狀細胞無顯著變化。有研究顯示蛻膜樹突狀細胞與子宮蛻膜血管生成有關[12]。Blois等[13]的研究顯示，接種樹突狀細胞能夠減少妊娠小鼠的自然流產發生率，但其確切的調節機制有待深入研究。而在小鼠的圍植入期去除樹突狀細胞時，子宮部分蛻膜出現分化缺陷，植入過程受損，植入位點的血管減少，基質細胞增生缺陷，胎盤發育受損及妊娠失敗[13]。所以在妊娠時母胎界面大量出現的成熟蛻膜樹突狀細胞可能在胚胎植入及妊娠維持中發揮著重要的作用。

除了上述免疫細胞外，蛻膜中還有一定量的T細胞發揮著重要的作用。在妊娠早期，一方面CD8+T細胞表現為暫時性細胞毒性功能障礙，有益于免疫耐受的維持[14]；另一方面，在滋養層細胞的刺激下，蛻膜CD8+T細胞高表達Tim-3、CTLA-4或PD-1，使其具有高增殖性，從而分泌大量的IL-4和IL-10等細胞因子，對母胎耐受維持具有積極的作用[15]。在Lachapelle等[16]的研究中，復發性流產人群患者蛻膜中CD8+T細胞數量明顯減少，這進一步證明CD8+T細胞對于妊娠維持具有重要作用。然而在本研究中，稽留流產患者組中CD8+T細胞數量卻顯著上升，這與Galgani等[17]在正常人群和復發性流產患者對照研究中的結果一致，復發性流產患者蛻膜中CD8+T細胞數量顯著增加。表明過多的CD8+T細胞可能也會帶來不良妊娠結局。不同的檢測人群、樣本量的大小及實驗環境等差異可能會造成以上相悖的結論，蛻膜CD8+T細胞對于復發性流產及稽留流產患者的影響還需要更深入的研究。

除了CD8+T細胞在稽留流產患者組中顯著上升，以Foxp3+為表面標記的Treg細胞的數量也顯著增加。Treg是一類調節性T細胞[18]，于妊娠早期迅速升高，能夠釋放TGF-β、IL-10等細胞因子來抑制滋養層細胞的凋亡，誘導子宮螺旋動脈重塑及胎盤的發育，在母胎免疫耐受及早期妊娠維持中發揮著重要作用[19-21]。早在2004年，Sasaki等[22]的研究就初次報道了Treg細胞與自然流產的關系，他們發現自然流產患者外周血和蛻膜中的Treg細胞數顯著低于人工流產患者組，并提出流產的發生可能與Treg細胞數量增加不足有關；近年來的研究也顯示，不明原因復發性流產患者蛻膜的Treg細胞數顯著低于正常女性組[23]。然而本研究得出了相反的結論，稽留流產組相較于人工流產組患者蛻膜Treg細胞數顯著上升。另外，Treg細胞可能與來源于同一細胞系的Th17細胞協同參與妊娠的維持。研究發現，Th17/Treg細胞的平衡在其中發揮著重要的作用[24]。Th17/Treg細胞失衡將誘導其他免疫細胞分泌IL-22、γ-干擾素及TNF-α等免疫殺傷因子，影響正常的胎盤細胞的分化生長，最終使滋養層細胞發育異常，母體對胚胎產生排斥作用，導致流產[25]。本研究中僅研究了Treg細胞數量在稽留流產組中的變化，不能全面反映Th17/Treg細胞平衡狀態的變化，有待進一步對Th17細胞相關標志物進行測定，探究Th17/Treg細胞平衡與流產的關系。

綜上所述，妊娠早期，子宮蛻膜中大量增加的NK細胞、巨噬細胞及成熟樹突狀細胞均在母胎免疫耐受及妊娠的維持中發揮著重要的作用。了解早孕期子宮蛻膜免疫細胞譜能夠更好地理解生殖免疫在妊娠的建立和維持中發揮的作用。其中，稽留流產患者組中顯著增加的CD68+巨噬細胞及CD8+T細胞可能與自發流產有關，這可能與免疫耐受機制被破壞有關，其具體機制還需要深入的研究。對于Treg細胞的分析，需要加入同一源系的Th17細胞來綜合探討Th17/Treg細胞之間的平衡對于自發流產的影響。本研究采用的全自動免疫組織化學儀器及自動病理成像定量分析系統已應用于臨床免疫細胞分析，從標本的收集制備蠟塊到實驗及數據分析已形成系統化的平臺[26-27]，相較于流式細胞學技術，除了可以進行定量各免疫細胞，更方便定位這些免疫細胞表達位置是否存在差異。但由于本研究所選取的稽留流產組樣本并未在胎停的時刻進行取樣，受到機體本身免疫防御的影響，可能會對免疫細胞的數量產生影響；除此之外本研究中樣本量較少，人工流產患者多在早孕期檢測出妊娠陽性時選擇進行手術，對于孕周較大的樣本取樣困難，需要進一步擴大樣本量來進行大樣本的對照研究，描繪出更為全面、可信度更高的早孕期蛻膜免疫細胞譜。